人表皮生長因子hEGF在螺旋藻中的表達研究.pdf

1、表皮生長因子(Epidermal Growth Factot，EGF)是由53個氨基酸組成的多肽。因具有多種生物學(xué)活性和廣泛的臨床應(yīng)用前景， EGF及其受體家族的研究成為近年來生物學(xué)研究的熱點之一。螺旋藻是一類特殊的原核生物，它作為一種天然綠色食物，具有高安全性和高營養(yǎng)價值的特點，有著巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力。本實驗的目的在于實現(xiàn)人表皮生長因子在螺旋藻中的表達，省去下游的分離純化，以期開發(fā)出外敷產(chǎn)品應(yīng)用于美容和皮膚燒傷、創(chuàng)傷的治療、直接口服的

2、美容保健品。 首先，構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化的供體表達載體。根據(jù)螺旋藻密碼子的偏嗜性，設(shè)計引物，用PCR技術(shù)擴增得到人表皮生長因子基因。利用NspI和NspI這兩種同尾酶，經(jīng)過多步鏈接、測序，構(gòu)建成含有四個串聯(lián)目的基因的重組載體。然后將此串聯(lián)片段插入到含有藍藻源的熱休克groESL啟動子、rbcS polyA終止區(qū)、同源重組片段recA基因和nptII基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建成供體表達質(zhì)粒pKREGF4。 其次，將構(gòu)建好的供體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

3、螺旋藻。我們將供體質(zhì)粒用超聲轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化鈍頂螺旋藻，通過G418篩選，得到三株具有G418抗性且生長良好的轉(zhuǎn)化藻株，分別命名為EGFA，EGFB，EGFC。以外源片段兩側(cè)引物對轉(zhuǎn)化藻株的基因組DNA進行PCR擴增，證明目的片段已經(jīng)整合到宿主的基因組DNA中。轉(zhuǎn)化藻通過41℃熱誘導(dǎo)后，進行SDS-PAGE，通過Western-blot，發(fā)現(xiàn)EGFB，EGFC藻株存在與預(yù)期外源目的基因表達產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)?.87kD左右的特異雜交帶，證實特

4、異蛋白的存在。而EGFA可能由于外源目的基因表達量過低或者基因未表達，沒有檢測到雜交信號。我們選取生長狀態(tài)較好的轉(zhuǎn)化藻EGFC進行大量培養(yǎng)，為后期驗證轉(zhuǎn)基因藻功能的動物實驗做準(zhǔn)備。 最后，我們通過乙酸誘導(dǎo)大鼠急性胃潰瘍的實驗，初步證明轉(zhuǎn)基因螺旋藻在治療大鼠急性胃潰瘍方面有一定的功效，轉(zhuǎn)基因藻的治療效果好于野生藻，體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因螺旋藻藻的優(yōu)越性。 本研究通過超聲轉(zhuǎn)化的方法將目的基因人表皮生長因子hEGF片段整合到螺旋藻Spi