熱習服上調(diào)Treg細胞減輕小鼠熱應激損傷的研究.pdf

1、目的:
　　熱應激損傷是指機體在持續(xù)的熱應激作用下，發(fā)生的一系列應激性生理變化和病理性的損傷，俗稱中暑，現(xiàn)代醫(yī)學中的熱痙攣、熱衰竭、熱射病等，均屬于熱應激損傷，多見于持續(xù)的熱環(huán)境暴露或高強度運動，不僅影響在熱環(huán)境下的作業(yè)能力，更對機體的健康造成嚴重危害。其主要的發(fā)生機制是由于機體從外界熱環(huán)境獲得的熱量和自身產(chǎn)熱之和，超出了機體的最大散熱效率，熱量逐漸蓄積無法散失，導致下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞調(diào)控失能，機體核心體溫被動升高，內(nèi)臟血流大量向

2、皮膚轉(zhuǎn)移，各臟器功能紊亂，細胞發(fā)生缺血缺氧損傷，釋放多種物質(zhì)激活炎癥相關(guān)信號通路，誘導急性系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，而過度激烈的炎癥反應的發(fā)生，又對臟器造成了更嚴重的損傷，以至于可進一步發(fā)展為多器官衰竭綜合征，甚至導致死亡。
　　熱習服(heat acclimation，HA)是機體在長期的熱環(huán)境暴露后，身體組織在各個水平達到一個新的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生一系列有利于適應熱環(huán)境，提高耐熱能力的變化;機體在形成熱習服后，能夠防止熱應激損傷的發(fā)生，或降低

3、熱應激損傷的嚴重程度。熱習服后熱耐受能力提高的機制復雜，尚不完全明確，已有大量的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熱習服提高熱耐受、減輕熱應激損傷的原理包括熱習服后基礎(chǔ)代謝率降低、血容量增加、排汗功能改善、心血管系統(tǒng)功能增強、對汗液中鈉離子的重吸收增強等;而在后期的全身炎癥反應發(fā)生期間，熱習服是否也存在相應的機制減輕炎癥的發(fā)生，從而降低損傷程度，目前尚不清楚。
　　在本研究中，對熱習服小鼠的外周免疫器官中免疫細胞亞群進行了分析，最后以調(diào)節(jié)性T細胞(r

4、egulatory T cell，Treg)對炎癥的負調(diào)控作用為切入點，探究了熱習服對熱應激損傷的保護作用與Treg細胞的關(guān)系，并對其機制進行了初步的研究探討，為探明熱習服提高機體熱耐受、減輕熱應激損傷的免疫機制研究提供思路。
　　方法:
　　1.建立熱習服小鼠模型，初步明確熱習服提高小鼠熱耐受與免疫細胞亞群的改變。
　　2.分選未熱習服小鼠脾臟、淋巴結(jié)的Treg細胞，尾靜脈輸入同樣未熱習服的小鼠，觀察Treg細胞的輸

5、入對熱應激環(huán)境下小鼠生存率的影響，進行組織病理切片對比臟器損傷情況，探討Treg細胞的上升是否對熱應激損傷具有保護作用。
　　3.引入Treg細胞缺陷的microRNA-155(Mir-155)基因敲除小鼠，與普通小鼠在同樣熱應激下的死亡情況進行對比，明確Treg細胞缺乏是否降低小鼠熱應激耐受。并對熱應激小鼠的脾臟中性粒細胞和Treg進行流式細胞檢測細胞頻率，進一步明確Treg細胞與熱應激損傷程度的相關(guān)性。
　　4.通過流式

6、細胞術(shù)檢測熱習服和未熱習服小鼠在熱應激下血液中性粒細胞頻率變化情況，以及脾臟中性粒細胞與Treg細胞頻率，分析脾臟Treg細胞頻率與中性粒細胞頻率的相關(guān)性。
　　5.通過免疫組化對脾臟叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein-3，F(xiàn)oxp3)和程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-Ligand1，PD-L1)分子表達進行檢測，細胞共培養(yǎng)實驗驗證Treg與中性粒細胞之間的相互作用，對熱

7、習服提高機體熱耐受的機制進行初步研究。
　　結(jié)果:
　　1.對熱習服小鼠和未熱習服小鼠的主要免疫細胞分群進行比較，發(fā)現(xiàn)熱習服小鼠Treg細胞在脾臟、淋巴結(jié)中頻率明顯上調(diào)。
　　2.通過對比同樣熱應激下熱習服小鼠與未熱習服小鼠存活情況，發(fā)現(xiàn)未熱習服組小鼠死亡率更高、臟器受損程度更為明顯，推測熱習服提高小鼠的熱耐受與Treg細胞上調(diào)有關(guān)。
　　3.采用流式分選獲取未熱習服小鼠脾臟、淋巴結(jié)的Treg細胞，尾靜脈輸入同樣

8、未熱習服的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在熱應激下的死亡率顯著降低，臟器損傷也有所減輕，證明Treg細胞輸入能夠達到類似于熱習服的效果，減輕熱應激損傷的嚴重程度。
　　4.Treg細胞缺陷的Mir-155基因敲除小鼠和普通小鼠進行熱應激實驗，發(fā)現(xiàn)Mir-155基因敲除小鼠在同樣強度熱應激下的死亡率更高，進一步證實了Treg細胞與熱應激損傷的相關(guān)性。
　　5.對高熱應激后脾臟中性粒細胞頻率與Treg細胞頻率進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈良好的負相關(guān)，

9、推測Treg細胞能夠抑制急性炎癥反應中的中性粒細胞募集，從而減輕熱應激下臟器損傷程度。
　　6.免疫組化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未熱習服小鼠相比，熱習服小鼠脾臟PD-L1和foxp3分子顯著上調(diào)，提示熱習服能夠上調(diào)PD-L1和Foxp3的表達，從而誘導Treg細胞的增加，發(fā)揮更強的免疫負調(diào)控作用。
　　7.細胞共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)Treg細胞與中性粒細胞共培養(yǎng)體系中，熱刺激誘導的髓過氧化物酶釋放減少，提示Treg細胞能夠抑制中性粒細胞的活

10、化;通過阻斷不同的信號通路，對其機制進行初步探討，發(fā)現(xiàn)Treg主要通過PD-1/PD-L1信號通路抑制中性粒細胞的活化。
　　結(jié)論:
　　研究檢測了小鼠在形成熱習服后，外周免疫器官的各種免疫細胞的頻率變化，發(fā)現(xiàn)Treg細胞頻率有所上調(diào)，熱習服提高機體熱耐受的機制可能與Treg細胞對急性炎癥的負調(diào)控作用相關(guān)。熱習服能夠誘導小鼠脾臟Treg細胞頻率上調(diào)，可能與熱習服后PD-L1分子、Foxp3分子的上調(diào)有關(guān)，Treg上調(diào)可減輕熱