磁珠和熒光編碼微球標記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、目的：
　　血型鑒定是保證輸血安全的關(guān)鍵手段，隨著醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的血型系統(tǒng)、血型抗原被證實與輸血安全密切相關(guān)，對更多的抗原靶標進行快速準確的鑒定可進一步提高個性化醫(yī)療服務(wù)水平。然而，目前臨床使用的血清學方法只能進行單個血型抗原靶標檢測，更多血型抗原數(shù)量的分析將顯著增加檢測時間并提高人力和經(jīng)濟成本。為此，本研究分別基于固相微陣列技術(shù)與液相微陣列技術(shù)，利用其高通量優(yōu)勢，同時結(jié)合磁珠和熒光編碼微球的標記技術(shù)，分別探索了磁珠標記的微

2、陣列血型鑒定技術(shù)和熒光編碼微球標記的血型鑒定技術(shù)，以達到快速檢測多個血型抗原的目的。
　　方法：
　　磁珠標記的微陣列血型鑒定技術(shù)中，使用的反應(yīng)基片經(jīng)過醛基多聚分子修飾，在基片表面形成具有三維結(jié)構(gòu)的醛基聚合物，可以偶聯(lián)抗體蛋白分子。檢測前先用Tris-HCl(pH=7.3～7.5)裂解紅細胞標本，并將0.2μl處理后的待測標本加在固定有抗體探針的樣點上，隨后用0.2μl磁珠標記的C1q識別抗原抗體復合物，最后在磁力吸附下將未

3、結(jié)合的磁珠清除。在定量分析中，對每個微陳列檢測點攝影后，用Photoshop進行圖像分析識別信號強度。
　　經(jīng)技術(shù)改進，在傳統(tǒng)的液相微陣列技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光編碼微球標記技術(shù)，探索了熒光編碼微球標記的微陣列技術(shù)。技術(shù)中，用熒光編碼微球標記血型抗體，同時用磁珠標記血凝素分子。檢測時，在100μl生理鹽水中加入5μl熒光編碼微球標記抗體、1μl的全血標本以及5μl磁珠標記的血凝素分子;反應(yīng)后進行磁分離，最后用Luminex熒光編碼

4、微球檢測儀對上清中的微球進行分類計數(shù)，通過比較每種微球的相對數(shù)量來判斷血型抗原的結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　磁珠標記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)中需要保持反應(yīng)環(huán)境的濕潤，以含有40％甘油的PBS作為反應(yīng)介質(zhì)，能有效避免咖啡環(huán)的形成，使C1q分子識別抗原抗體復物的反應(yīng)能正常進行。以EDAC、NHS做為偶聯(lián)劑，C1q分子能較好的包被子磁珠表面。當抗體探針濃度在100μg/ml，上樣量0.2μl，同時每個樣點所需的待測標本量0

5、.2μl時（約105個RBCs）其檢測效果較好。磁分離時，磁針長度需要控制在4～6 cm，完成檢測需要10～20分鐘的反應(yīng)時間。通過對108個血液標本的分析鑒定，表明A、B、D、M、N五種抗原的敏感度分別為93.18％、83.72％、92.39％、93.24％、90.36％，特異性均為100.00％。
　　熒光編碼微球標記的微陣列血型鑒定技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，100萬個微球與抗體偶聯(lián)后A、B、D、M、N五種抗體的下降量分別為0.17、0

6、.61、0.40、0.31和0.94μg，對應(yīng)單個微球表面偶聯(lián)的抗體分子數(shù)量分別約為10萬、38萬、160萬、140萬和377萬個。反應(yīng)檢測需要將每種熒光微球的數(shù)量控制在2000～10000之間，紅細胞數(shù)量106個左右，對應(yīng)數(shù)量比為1∶100～20，可以在2 min以內(nèi)完成檢測。通過對276例臨床標本的A、B、D、M、N血型抗原的分析鑒定，技術(shù)的靈敏度與特異性均可達到100％，對長期保存后的血液標本以及1+的弱凝集標本也有同樣的檢測效果