丁苯酞通過抗凋亡作用而減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)損害.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以髓鞘脫失、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、軸索病變和進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙為主要特點的常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病。該病病程反復(fù)，致殘率高，加重家庭與社會負(fù)擔(dān)。但是引起多發(fā)性硬化的確切的病因及其發(fā)病機制目前尚不清楚。目前認(rèn)為是由于環(huán)境因素、遺傳易感性、自身免疫異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素綜合作用的結(jié)果。
　　細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，是一種由基因調(diào)節(jié)控制的細(xì)

2、胞程序性死亡過程。目前大量研究已證明:線粒體是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起至關(guān)重要作用的細(xì)胞器，而線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致多發(fā)性硬化和EAE模型中髓鞘脫失、軸索和神經(jīng)元的變性。
　　丁苯酞(dl-3n-butlphalide,NBP)是人工合成的消旋體，2002年，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)丁苯酞可以應(yīng)用于中風(fēng)患者。實驗證明丁苯酞可以通過改善供血、保護血腦屏障、抗血栓形成、改善線粒體功能等途徑發(fā)揮腦保

3、護作用，目前廣泛應(yīng)用在治療缺血性腦血管病方面，并已取得良好效果。但目前國內(nèi)外對于丁苯酞對于多發(fā)性硬化是否具有治療作用的研究很少，關(guān)于丁苯酞對多發(fā)性硬化線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷以及對多發(fā)性硬化的細(xì)胞凋亡影響，尚未見報道。本研究通過觀察對丁苯酞對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護作用，從而為臨床治療多發(fā)性硬化提供新的方法。
　　實驗

4、性自身免疫性腦脊髓炎是目前國內(nèi)外公認(rèn)的多發(fā)性硬化研究的理想動物模型，是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍單個核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病。本實驗以丁苯酞作為干預(yù)藥物，通過觀察實驗動物神經(jīng)功能評分及Tunel染色陽性細(xì)胞表達(dá)變化情況，探討丁苯酞能否通過抗細(xì)胞凋亡作用而減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)損傷作用，為臨床探索新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、實驗動物購買與飼養(yǎng):選擇健康C57BL/6雌性小

5、鼠45只，周齡介于6-8周，體重在180～220g之間，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。隨機分籠，以標(biāo)準(zhǔn)飼料、自來水飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室實驗動物中心，環(huán)境恒溫20～25℃。
　　2、實驗動物分組:將免疫發(fā)病后C57BL/6小鼠36只隨機分為EAE組(E，生理鹽水0.1ml/d/只)、地塞米松組（D，地塞米松注射液0.07mg/只）、丁苯酞低劑量組（L，丁苯酞80mg/d/只）及丁苯酞高劑量組（H，丁苯酞1

6、20mg/d/只）。另取9只正常小鼠為正常對照組（N，生理鹽水0.1 ml/d/只）。小鼠發(fā)病當(dāng)天（0天），地塞米松組、丁苯酞低劑量組及高劑量組分別于發(fā)病后每日腹腔注射相應(yīng)劑量藥物。正常組及EAE組僅每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水，共14天。各組再以發(fā)病后0天、7天、14天分為三個亞組，每個亞組3只小鼠。
　　3、EAE模型的建立:用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成6mg/ml，并按1∶1等體積加入完全弗氏佐劑（加入結(jié)核桿菌H

7、37Ra使其終濃度為4mg/ml），混合乳化。充分乳化后將小鼠用乙醚麻醉，將小鼠充分固定后于小鼠背部脊柱兩側(cè)分四點皮下注射（每只0.1ml），第0h及第48h后腹腔注射0.5ml PTX。正常組小鼠不作上述處理。
　　4、實驗小鼠神經(jīng)功能評分:自免疫當(dāng)天起每日早晚兩次（間隔約8小時），由兩名觀察者同時對小鼠進(jìn)行稱重、神經(jīng)功能評分。采用國際通用的Benson（5分）評分標(biāo)準(zhǔn)對實驗小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分:
　　具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0

8、分無任何臨床癥狀;1分小鼠尾部張力消失，不能上抬，步態(tài)可見輕度笨拙;2分小鼠雙后肢均無力，被動翻身可恢復(fù);3分小鼠雙后肢癱瘓，被動翻身后，不能自行恢復(fù)，但是給予刺激后可以挪動;4分小鼠雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁;5分瀕臨死亡或死亡。評分時如果小鼠臨床癥狀介于兩個評分之間，則選取較低分?jǐn)?shù)加0.5分來表示。
　　5、取材:于發(fā)病當(dāng)天（0天）:EAE組、正常對照組各取3只;發(fā)病第7天、14天:EAE組、丁苯酞低劑量組、丁苯

9、酞高劑量組、地塞米松組各取3只;給予10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，先以生理鹽水心臟灌注（流出液無血液后），再以4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后，取脊髓腰膨大處組織常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片，5μm連續(xù)切片。應(yīng)用Tunel染色法測定凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、實驗小鼠免疫后發(fā)病情況:小鼠在接受免疫后一周左右出現(xiàn)精神萎靡、皮毛不整、活動減少、體重下降等。免疫10天后左右小鼠開始發(fā)病，表現(xiàn)為尾部上抬

10、無力，張力消失，肌張力下降，肢體癱瘓、部分出現(xiàn)四肢癱等。
　　2、動物神經(jīng)功能評分
　　發(fā)病后第7天:L7、H7、D7組及E7組小鼠的神經(jīng)功能評分分別為1.67±0.76、1.50±0.5、1.33±0.29、2.67±0.87， L7、H7及D7組小鼠評分均小于EAE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），L7、H7及D7組間評分無明顯差異（P＞0.05）。
　　發(fā)病后第14天:L14、H14、D14組及E14組小鼠的

11、神經(jīng)功能評分分別為1.17±0.58、1±0.5、1±0、2.17±0.29，L14、H14、D14組小鼠評分均小于EAE組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，L14、H14及D14組間評分無明顯差異（P＞0.05）。
　　3、Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù):
　　正常組小鼠脊髓幾乎沒有Tunel染色陽性細(xì)胞。實驗組小鼠脊髓均有Tunel染色陽性細(xì)胞，散在分布于脊髓實質(zhì)及小靜脈周圍。凋亡細(xì)胞可能為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞等。E0

12、組、E7組、E14組Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)分別為39.33±4.56、40.37±4.23、34.30±4.33，E14組小鼠Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)少于E0組及E7組，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），E0組與E7組Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。
　　發(fā)病后第7天:L7、H7、D7組及E7組小鼠的Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)分別為23.53±4.92、21.53±3.49、22.67±4.06、40.37±4.2

13、3， L7、H7及D7組小鼠Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)均小于EAE組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，L7、H7及D7組Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。
　　發(fā)病后第14天:L14、H14、D14組及E14組小鼠的Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)分別為20.30±3.72、20.27±3.47、21.20±3.89、34.30±4.33，L14、H14、D14組小鼠Tunel染色陽性細(xì)胞數(shù)均小于EAE組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜