Cathepsin L介導的細胞凋亡在大鼠腦缺血再灌注后與Caspase-3的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　本實驗通過模擬人類急性腦卒中的模型—大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注模型(MCAO,middle cerebral artery occlusion)，并運用Cathepsin L抑制劑 Z-FY-DMK及 Caspase-3蛋白抑制劑Z-DEVD-FMK分別進行干預，檢測并分析腦梗死體積、腦缺血再灌注后不同時間點Cathepsin L與Caspase-3蛋白的表達變化，探討Cathepsin L與Caspase-3蛋白在神

2、經(jīng)細胞凋亡中的相互關(guān)系。
　　方法：
　　雄性健康清潔級 SD(Sprague-Dawley)大鼠162只，生長周期約10-12周，體重約260-300g。按照隨機數(shù)表法，將其分為假手術(shù)組(27只)和腦缺血再灌注組(簡稱模型組45只)，抑制劑Z-FY-DMK組(簡稱CL干預組45只)，抑制劑Z-DEVD-FMK(簡稱C-3干預組45只)，假手術(shù)組按再灌注6h、12h、24h、48h分成4個亞組，每組6只大鼠(其中48小時組9

3、只)。其余各組均按再灌注6h、12h、24h、48h分成4個亞組，每組10只大鼠(其中48小時組15只)。使用Longa線栓法制備局灶性右側(cè)大腦中動脈梗死模型，缺血2h后拔除線栓即形成在灌注，假手術(shù)組大鼠線栓插入深度為8-10mm，其余操作同模型組；CL干預組與C-3干預組分別采用側(cè)腦室穿刺法注射Cathepsin L特異性抑制劑 Z-FY-DMK及 Caspase-3蛋白抑制劑Z-DEVD-FMK(Z-FY-DMK：于MCAO前30分

4、鐘注射入右側(cè)側(cè)腦室，濃度為20ug/1ul，共5ul，留針10min；Z-DEVD-FMK：術(shù)前30min注射入右側(cè)側(cè)腦室10ul，濃度為0.5ug/0.5ul，留針10min，等量的DMSO溶液注射入假手術(shù)組和模型組于同一時間點及部位。)其中假手術(shù)組取3只大鼠，模型組48h和干預組48h均取5只大鼠行TTC染色。按通用的神經(jīng)功能缺損評分方法(Longa,s5級評分法)評估神經(jīng)功能缺損癥狀；采用TTC染色法、TUNEL法及Western

5、 blotting法，分別檢測腦梗死體積、缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡變化及Cathepsin L與Caspase-3的蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：
　　1.模型成功率88.24％；模型組48h相對梗死體積為38.25±1.06%，CL干預組48h相對梗死體積為26.00±1.414%，C-3干預組48h相對梗死體積為29±1.414%。
　　2.TTC染色中，48小時組時間點的各組腦組織中，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)病灶，模型組、

6、CL組、C-3組的缺血側(cè)下可見白色病灶，但CL組、C-3組相對梗死體積相對于模型組而言，明顯減少(P<0.001)，并且在CL干預組、C-3干預組的大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀與體征也發(fā)生了明顯改善(P<0.05)。
　　3.在腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的凋亡細胞檢測中，假手術(shù)組腦組織中凋亡細胞幾乎很少見，模型組6h可見凋亡神經(jīng)細胞，12h、24h、48h逐漸增多，呈上升趨勢；CL干預組和C-3干預組在6h、12h、24h、48h觀察到凋亡細胞與模型

7、組對應(yīng)時間點相比較，有明顯下降(p<0.05)。
　　4.在腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)的Western blotting檢測相關(guān)蛋白中，假手術(shù)組的腦組織中可以檢測到少量的Cathepsin L蛋白表達，模型組Cathepsin L蛋白，均在再灌注6小時開始上升，12h、24h達到高峰，48h仍保存高水平。與模型組比較，CL干預組與 C-3干預組的Cathepsin L蛋白表達在各時間點均明顯減弱(p<0.05)。
　　5.在大鼠缺血側(cè)皮

8、質(zhì)區(qū)，假手術(shù)組可以檢測到少量的Caspase-3蛋白表達，模型組Caspase-3蛋白，均在再灌注6小時開始上升，24h達到高峰，48h仍保存高水平。與模型組比較，CL干預組與C-3干預組的Caspase-3蛋白表達在各時間點均明顯減弱(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠腦缺血再灌注損傷后，Cathepsin L介導的Caspases凋亡通路中，可能與Caspase-3蛋白存在相互制約的關(guān)系。
　　2.Z-FY