牙髓干細胞復合微納結構HA修復牙槽骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的在于探討表面微納結構形貌修飾的輕基磷灰石（micro-nano structured hydroxyapatite，m n H A)生物陶瓷復合牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs)修復牙槽骨缺損的效果。首先，分離培養(yǎng)牙髓干細胞并探討其干細胞特性及成骨向分化能力；其次，體外研究mnHA對 DPSCs的生物學作用；最后，在大鼠牙槽骨缺損動物模型中探討mnHA復合DPSCs的體內

2、成骨效果。
　　材料和方法：
　　1.采用改良組織塊法原代培養(yǎng)人牙髓細胞，免疫磁珠法分選Stro-l+人牙髓干細胞。通過CCK8檢測人DPSCs的增殖活性；免疫熒光染色檢測細胞表面波形絲蛋白（Vimentin)、細胞角蛋白（cytokeratin，C K)、S-100和 Stro-1的表達;流式細胞術檢測其干細胞表面特征性標志物CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表達。
　　2.體外誘導人DP

3、SCs成脂向分化，油紅染色觀察成脂誘導后脂滴的形成情況。成骨誘導液誘導人D P S C s向成骨細胞分化，通過堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，A L P)染色觀察成骨誘導后細胞的成骨活性；茜素紅染色觀察礦化結節(jié)形成情況；Real-time P C R檢測成骨相關基因A L P、I型膠原（collagen I，Col I)、runt相關轉錄因子2(runt-related transcription fac

4、tor2，Runx2)和骨媽素（osteocalcin，O C N) m R N A的表達。
　　3.體外分離培養(yǎng)大鼠DPSCs后分別接種到mnHA生物陶瓷和表面光滑致密的傳統(tǒng) H A生物陶瓷上。通過細胞骨架蛋白染色、掃描電鏡（scanning electron microscope，S E M)、M T T、A L P染色和活性檢測以及 Real-time P C R檢測mnHA生物陶瓷對DPSCs的粘附、增殖以及促進成骨/成血

5、管相關因子表達的作用。
　　4.建立大鼠牙槽骨缺損動物模型并植入材料進行修復。實驗分為五組：（1)傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷（HA)；(2)表面微納結構形貌修飾HA生物陶瓷（mnHA)；(3)傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷復合大鼠DPSCs(HA+DPSCs)；(4)表面微納結構形貌修飾H A生物陶瓷復合大鼠DPSCs(mnHA+DPSCs)；(5)空白對照組（Control)。通過 Micro-CT、四環(huán)素/茜素紅/鈣黃

6、綠素三色序列熒光染色以及組織學觀察并檢測新骨的形成和礦化情況。
　　結果：
　　1.通過改良組織塊結合免疫磁珠法成功分離并純化人DPSCs。人 D P S C s形態(tài)多呈長梭形，具有較強的增殖能力，表達間充質干細胞表面標志物CD44、CD90、CD105、CD29和 Stro-1，而造血干細胞表面標志物CD34和 CD45陰性表達。
　　2.人 DPSCs成脂向誘導后，油紅染色可見脂滴形成。成骨向誘導后，人D P S

7、C s具有較強的成骨向分化潛能。在成骨誘導過程中，人 DPSCs A L P染色呈陽性，同時 ALP m R N A表達水平升高；成骨相關基因Col I和 Runx2 mRNA的表達呈先升高后下降的趨勢；而 OCN mRNA的表達隨著時間的推移呈不斷升高的趨勢；誘導21天茜素紅染色可見礦化結節(jié)形成。
　　3.與傳統(tǒng)表面光滑致密的H A生物陶瓷相比，表面微納結構形貌修飾的H A生物陶瓷可明顯促進大鼠DPSCs的早期粘附、增殖、成骨向

8、分化以及血管生長因子的表達，A L P活性明顯增加，成骨相關基因Runx2、O C N、牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，D S P P)和牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein-1，DMP-1)以及成血管相關基因血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1) mRNA

9、的表達增高。
　　4.大鼠牙槽骨缺損修復體內實驗發(fā)現(xiàn)，材料修復組骨體積和組織體積的比值(bone volume relative to tissue volume，B V/T V)、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. T h)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb. N)、序列焚光染色和新骨形成量均高于空白對照組。其中m n H A組 BV/TV、Tb. Th、Tb. N、序列熒光染色和新

10、骨形成較H A組高，而 mnHA生物陶瓷復合DPSCs后可進一步增強其在體內的成骨效果。
　　結論：
　　1.通過改良組織塊聯(lián)合免疫磁珠分選法可成功培養(yǎng)并獲得純度較高的人DPSCs,所獲得的細胞具備了間充質來源干細胞的生物學表型和特性，具有較強的成骨向分化潛能，在成骨、成脂誘導液作用下可分化為成骨細胞和脂肪細胞。
　　2.與傳統(tǒng)表面致密光滑的H A生物陶瓷相比較，表面微納結構形貌修飾的HA生物陶瓷具有促進DPSCs早期