LASP-1基因沉默對人口腔鱗癌SCC9細胞增殖和遷移的影響.pdf

1、口腔癌是威脅人類健康的主要腫瘤之一，已成為全球第九大好發(fā)性腫瘤，其中又以口腔鱗癌居多，具有生長快速、易侵襲和破壞鄰近組織的特點，并且還可發(fā)生遠處轉移。雖然外科手術治療的發(fā)展有了長足地進步，但是創(chuàng)傷大，易復發(fā)仍是尚未解決的難題，如何尋找到針對腫瘤的特異性的基因治療已然成為如今的研究熱點。通過前期研究發(fā)現(xiàn)LASP-1（LIM and SH3 protein1）蛋白主要位于肌動蛋白結合區(qū)域并參與細胞骨架的構成，在細胞趨化運動、遷移、黏附等過程

2、中發(fā)揮重要作用。已有研究指出LASP-1在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、成神經管細胞瘤以及肝細胞癌均呈高表達，且與患者臨床病理特征相關。但LASP-1與口腔腫瘤疾病的認識還有待深入，其是否可作為腫瘤基因治療的候選基因仍需探討。
　　目的：
　　由于LASP-1在人口腔鱗癌中的表達及其對細胞增殖和遷移能力影響的研究少見報道。為此本研究采用RNA干擾技術抑制人口腔鱗癌SCC9細胞中LASP-1的表達，觀察LASP-1對SCC9細胞增殖

3、和遷移能力的影響。
　　方法:
　　（1）細胞培養(yǎng)
　　人口腔鱗癌細胞株SCC9培養(yǎng)于DMEM/f12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清（澳洲），室溫下37°C，5% CO2溫箱培養(yǎng)。
　?。?）慢病毒包裝和轉導
　　將病毒包裝輔助質粒（pMD2G and PsPAX2）和shRNA表達質粒共轉染至人胚腎細胞293T中。48h后，12000g離心收集。將SCC9以3X104 cells/ml密度接種到6孔板

4、上。以MOI=50的病毒滴度進行轉染，三天后使用熒光顯微鏡（CKX41， Olympus）進行GFP表達觀察。
　　（3）定量RT-PCR和Western blot測定LASP-1表達情況
　　qRT-PCR通過TAKARA公司 SYBR?Premix Ex TaqII（Tli RNaseh Plus)系統(tǒng)完成。操作按照試劑盒說明書進行；BCA Protein assay測定蛋白濃度，將每份裂解的產物上樣、電泳、封閉后，分別

5、用一抗、二抗進行孵育。運用ECL發(fā)光液+膠片進行顯色，β-actin作為蛋白質內參。
　?。?）CCK-8法檢測細胞增殖情況
　　應用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖水平。設置空白對照孔，全自動定量繪圖酶標儀（Bio-Rad730）測量OD490m光吸收值，每組實驗重復3次。
　?。?）FACS（流式細胞儀）檢測分析細胞周期
　　經過胰蛋白酶消化后，4°C預冷的PBS洗滌細胞3次，離心棄上清，70%無水乙醇吹散細胞團

6、塊后4°C固定過夜，PI染料避光室溫孵育半小時。流式細胞儀（FACS Aria TMⅢ）進行檢測。
　?。?）Transwell實驗檢測細胞遷移能力
　　取對數(shù)生長期細胞，制備單細胞懸液，細胞加入transwell小室的上室中，而下室則加入10%胎牛血清的完全細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.25%結晶紫染料染色15 min。
　?。?）SEM掃描電鏡觀察細胞微觀形態(tài)學狀態(tài)
　　

7、根據(jù)實驗分組，將細胞稀釋至5x103/ml，接種1ml于細胞爬片，將爬片置于24孔板中，培養(yǎng)48h后，25%戊二醛固定30min，酒精（50%，75%，80%，90%，100%）梯度脫水，經零點干燥儀處理后，爬片表面進行噴砂導電，掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)。
　?。?）統(tǒng)計分析
　　檢測結果以（X±S）表示，檢驗水準為0.05。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA進行分析，方差齊時使用L

8、SD法對各組數(shù)據(jù)進行多重比較，若經Levene檢驗，數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，則采用Dunnett’s T3檢驗進行兩兩比較。
　　結果:
　?。?）經嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，檢測發(fā)現(xiàn)陰性對照組和空白對照細胞組內LASP-1 mRNA和蛋白表達無明顯差別。但實驗組SCC9細胞的mRNA和蛋白表達水平明顯下降。
　?。?）經過分析發(fā)現(xiàn)，陰性對照組和空白對照組無明顯區(qū)別，shRNA-LASP-1-Lv實驗組的相對增殖生長率

9、在2-6天均出現(xiàn)明顯抑制。
　?。?）LASP-1基因沉默可以阻滯細胞周期S期，SCC9陰性對照組21.68%±2.94%升高至實驗組30.53%±2.85%（F=14.18，P＜0.05）；G2/M期從陰性對照組5.50%±0.71%下降到實驗組3.50%±0.89%（F=5.29，P＜0.05）。而陰性對照組和空白細胞組G2/M和S沒有顯著差別。
　?。?）對細胞穿過聚碳酸酯膜進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，空白對照組和陰性對照組SCC9

10、均有多數(shù)細胞穿過，兩組間均無明顯差異。而實驗組有較少細胞到達下室，具有顯著統(tǒng)計學差異。SEM電鏡下觀察細胞偽足，實驗組細胞偽足相對減少。
　　結論:
　?。?）慢病毒載體介導的shRNA-LASP-1-Lv可以顯著下調人口腔鱗癌細胞SCC9中LASP-1的mRNA和蛋白表達。
　?。?）LASP-1基因沉默誘導導致SCC9細胞增殖水平降低，并且使細胞周期阻滯在S期，導致G2/M期降低。
　?。?）低表達LASP-