天然活性成分強心甾類固醇的靶向前體藥物的研究.pdf

1、強心甾類固醇（cardiotonic steroids，CTS）是一類具有強心作用的甾體類化合物，一般分為兩類：五元內(nèi)酯環(huán)強心苷類（如洋地黃苷、毛地黃強心苷、G-毒毛旋花子苷）和六元內(nèi)酯環(huán)強心苷類（如蟾蜍甾類、海蔥類）。近年來，強心甾類固醇在抑制惡性腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)癌細胞凋亡方面顯示出巨大潛力，其在臨床上預(yù)防和治療癌癥效果方面也倍受期待。強心苷藥物地高辛、毒毛花苷G和半合成藥物UNBS1450等已投入到臨床腫瘤治療研究中，然而療效卻遠

2、遠未達預(yù)期。將強心甾類固醇物質(zhì)應(yīng)用于臨床腫瘤治療還需解決很多問題，如心臟毒性大、臨床治療窗窄、藥物遞送率低以及腫瘤組織靶向性差等。因此，強心甾類固醇應(yīng)用于臨床腫瘤治療依然有很長的路。目前，研究趨向于開發(fā)無心臟毒性而抗腫瘤活性增強的先導(dǎo)化合物。本文從香加皮和北葶藶子中篩選得到六種強心甾類固醇成分，體外抑瘤實驗證實六種強心甾類固醇成分具有良好的抗腫瘤效果。以提取得率、前藥合成工藝難易程度為考慮指標(biāo)，選擇從香加皮提取得到的杠柳苷元（強心甾類固

3、醇糖配體成分）和杠柳次苷（強心苷類成分）為研究對象，合成高效低毒的靶向前體藥物和靶向納米前藥，并對靶向偶聯(lián)物前藥和納米前藥進行了體內(nèi)外評價，為強心甾類固醇臨床腫瘤治療提供新方法和新思路。
　　第一章強心甾類固醇的抗腫瘤研究及前體設(shè)計在提高腫瘤靶向性和活性中的應(yīng)用研究進展
　　本章對天然活性成分強心甾類固醇的抗腫瘤機理及前體藥物設(shè)計的研究現(xiàn)狀進行了綜述。同時，闡述了本文研究對象，即杠柳苷元和杠柳次苷的研究現(xiàn)狀。針對杠柳苷元和杠

4、柳次苷應(yīng)用面臨的問題，本論文提出了解決方案，確立了立題依據(jù)和設(shè)計思路與構(gòu)想，為本論文實驗工作的順利開展奠定了良好的理論基礎(chǔ)。
　　第二章天然產(chǎn)物抗腫瘤活性成分的篩選及其結(jié)構(gòu)分析
　　本章選擇天然產(chǎn)物北葶藶子和香加皮為主要研究對象，通過活性追蹤法從香加皮和北葶藶子中篩選分離得到六種具有細胞毒性的化合物，采用核磁共振氫譜、碳譜及二維圖譜、質(zhì)譜和紅外圖譜進行了結(jié)構(gòu)分析。考察了六種活性成分的體外抗腫瘤活性。
　　1、天然產(chǎn)物抗

5、腫瘤活性成分的篩選：以水提取北葶藶子后濃縮成浸膏，乙醇沉淀蛋白，用乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，各部位各部位進行體外抗腫瘤活性評價，結(jié)果顯示，二氯甲烷和正丁醇部位具有良好的體外抗腫瘤活性。采用正反相硅膠柱層析法分離純化活性部位，從二氯甲烷部位篩選得到活性成分1，得率為0.0013％，從正丁醇部位篩選得到活性成分2和3，得率分別為0.00071%和0.000043%。以同樣的篩選方法，從香加皮正丁醇部位中分離純化得到化合物4，

6、得率為0.038%?；衔?經(jīng)過酸水解和酶水解分別得到化合物5和6，得率分別是0.0153%和0.02295%，均顯著高于北葶藶子化合物1-3的提取得率。
　　2、活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性比較：經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜及二維圖譜、質(zhì)譜和紅外圖譜對活性成分進行了結(jié)構(gòu)鑒定，化合物1-3經(jīng)鑒定分別為葶藶苷、伊芙苷和伊芙雙苷，均為首次從北葶藶子中篩選得到的化合物。從香加皮中篩選得到的化合物4-6，經(jīng)鑒定分別是杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷

7、。該六種化合物均為強心甾類固醇成分。MTT法考察了單體成分的體外抗腫瘤活性，體外細胞毒性結(jié)果顯示，杠柳次苷的抗腫瘤活性最強（對MCF-7的IC50為0.019±0.012μg/mL），構(gòu)效關(guān)系表明，強心苷結(jié)構(gòu)中糖的數(shù)目和種類對活性有一定的影響。同時強心甾類固醇成分對腫瘤細胞的毒性明顯強于5-Fu，而對正常細胞的毒性小于5-Fu。
　　第三章奧曲肽偶聯(lián)杠柳苷元靶向治療肝癌的實驗研究
　　奧曲肽（OCT）被臨床應(yīng)用于治療和診斷S

8、STRs高表達惡性腫瘤，隨著其在腫瘤造影中的成功利用，亦被用于藥物腫瘤傳遞系統(tǒng)中。本章采用直接酸水解香加皮正丁醇部位分離純化得到杠柳苷元（PPG），其得率顯著提高，為0.048%。以杠柳苷元為研究對象，合成了奧曲肽-杠柳苷元（OCT-PPG）的偶聯(lián)物，并對各種偶聯(lián)物進行細胞毒性研究。建立了杠柳苷元在小鼠血漿、臟器和實體瘤組織中的檢測方法?？疾炝烁芰赵蛫W曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)物在小鼠體內(nèi)組織分布特性。建立了小鼠移植性肝癌（H22）實體瘤模

9、型。評價了奧曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)物的體內(nèi)抑瘤效果及其心臟和肝臟毒性。
　　1、奧曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)物的合成及其體外細胞毒性的評價：采用酸水解法制備杠柳苷元。經(jīng)紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果表明，成功制備了杠柳苷元。以丁二酸酐為連接劑，合成得到奧曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)物，分別為奧曲肽（苯丙氨酸）-杠柳苷元偶聯(lián)物OCT(Phe)-S-PPG、奧曲肽（賴氨酸）-杠柳苷元偶聯(lián)物OCT(Lys)-S-PPG和杠柳苷元-奧曲肽-杠柳苷元偶聯(lián)

10、物OCT-2S-2PPG。通過LC-MS、紅外、質(zhì)譜、核磁共振氫譜對上述三種反應(yīng)產(chǎn)物進行表征。采用MTT法測定OCT(Phe)-S-PPG、OCT(Lys)-S-PPG和OCT-2S-2PPG的細胞毒性，結(jié)果顯示，OCT(Phe)-S-PPG對HepG2的IC50值顯著低于PPG，而對L-02細胞的IC50值顯著高于PPG，表明與OCT結(jié)合后，增強了PPG對HepG2的細胞毒性，降低了對L-02細胞的毒性?？疾炝薕CT對OCT(Phe)

11、-S-PPG細胞毒性的影響，結(jié)果顯示，OCT顯著抑制了OCT(Phe)-S-PPG對HepG2的細胞毒性，表明OCT(Phe)-S-PPG對細胞毒性的增強與SSTRs受體介導(dǎo)的內(nèi)吞有關(guān)。細胞攝取實驗也證實了OCT(Phe)-S-PPG能顯著增強PPG在HepG2中的吸收。
　　2、OCT(Phe)-S-PPG的組織分布和藥效學(xué)研究：建立了杠柳苷元在小鼠血漿、臟器和實體瘤組織中分布的HPLC檢測方法。建立了H22肝癌實體瘤小鼠模型。

12、考察了OCT(Phe)-S-PPG在小鼠體內(nèi)的組織分布，并進行了藥效學(xué)研究。尾靜脈注射給藥后，OCT(Phe)-S-PPG能顯著提高PPG在瘤組織中的分布，同時降低了PPG在心臟和肝臟組織中的分布。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，OCT(Phe)-S-PPG對H22實體瘤的抑制率顯著高于PPG組（69.4%vs52.18%, P<0.01）。病理切片結(jié)果顯示，PPG組心臟組織表現(xiàn)為心肌細胞呈不規(guī)則排列，有少量炎癥細胞浸潤，肝組織表現(xiàn)為肝細胞索紊亂，

13、肝細胞發(fā)生水泡變性、壞死，肝竇變寬和肝竇淋巴細胞增多，與對照組相比，OCT(Phe)-S-PPG組未見明顯病理變化。說明OCT(Phe)-S-PPG能顯著降低PPG的心臟和肝臟毒性。以上實驗結(jié)果表明杠柳苷元偶聯(lián)奧曲肽后其對腫瘤細胞和腫瘤組織選擇性顯著提高，同時降低其體內(nèi)毒性。
　　第四章奧曲肽偶聯(lián)杠柳次苷靶向治療肝癌的實驗研究
　　本章采用酶解法從香加皮分離純化得到杠柳次苷，其細胞毒性明顯強于杠柳苷元。對杠柳次苷制備工藝進行

14、了優(yōu)化。合成了奧曲肽-杠柳次苷（OCT-PPM）的偶聯(lián)物。對多種偶聯(lián)物進行了表征和細胞毒性研究。建立了杠柳次苷在小鼠血漿、臟器和實體瘤組織中的HPLC檢測方法?？疾炝烁芰诬蘸蛫W曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物在小鼠體內(nèi)組織分布特性。以H22肝癌實體瘤為模型，評價了杠柳次苷和奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物的體內(nèi)抑瘤效果及其心臟和肝臟毒性。
　　1、酶解法轉(zhuǎn)化杠柳毒苷制備杠柳次苷的條件優(yōu)化：以酶解轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，考察了溫度、PH值、底物濃度、酶量、反應(yīng)時

15、間等因素對酶解轉(zhuǎn)化率的影響。最佳條件：溫度50℃、反應(yīng)介質(zhì)pH=5.0檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，底物質(zhì)量濃度為50 g/L，酶與底物比為0.6:1，反應(yīng)時間24 h。反應(yīng)產(chǎn)物相對分子量為534.63，經(jīng)核磁圖譜證實為杠柳次苷，得率為0.075%。
　　2、奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物的合成及其體外細胞毒性的評價：以丁二酸酐為連接劑，合成得到奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物，分別是OCT(Phe)-S-PPM、OCT(Lys)-S-PPM和OCT-

16、2S-2PPM。通過HPLC-UV、紅外、核磁共振氫譜對上述三種反應(yīng)產(chǎn)物進行了表征，結(jié)果證實得到了純度在95%以上的多種奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物。以MTT法評價各種奧曲肽-杠柳次苷偶聯(lián)物的細胞毒性，結(jié)果顯示OCT(Phe)-S-PPM對腫瘤細胞MCF-7和HepG2的毒性最強，且顯著高于PPM的毒性，而對L-02細胞毒性顯著低于PPM。表明OCT(Phe)-S-PPM能提高PPM的抗腫瘤活性并降低對正常肝臟細胞的毒性，具有一定的選擇性。<

17、br>　　3、OCT(Phe)-S-PPM的組織分布和藥效學(xué)研究：尾靜脈注射給藥后，PPM在肝臟、腎臟和心臟中分布最多，而在腫瘤組織中分布較少。OCT(Phe)-S-PPM能顯著提高PPM在小鼠瘤組織中的分布，并降低PPM在心臟和肝臟組織中的分布。表明OCT(Phe)-S-PPM提高了PPM的腫瘤靶向性和藥物遞送效率。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，PPM和OCT(Phe)-S-PPM組的H22肝癌實體瘤體積均明顯低于空白對照組。OCT(Phe)-

18、S-PPM對小鼠H22實體瘤的抑制率為69.4%，顯著高于PPM組(52.18%，P<0.01)。病理切片結(jié)果顯示，PPM組心臟組織表現(xiàn)為心肌細胞排列不規(guī)則，伴有淋巴細胞浸潤。肝組織表現(xiàn)為肝細胞萎縮、肝細胞索變細、肝竇變寬和肝竇淋巴細胞增多，而OCT(Phe)-S-PPM組未見明顯病理變化，肝功能檢查結(jié)果亦顯示OCT(Phe)-S-PPM的肝毒性明顯小于PPM，表明OCT(Phe)-S-PPM能顯著降低PPM的心臟和肝臟毒性?？瞻讓φ战M

19、的腫瘤組織表現(xiàn)為腫瘤細胞密集和細胞核濃染。PPM組和OCT(Phe)-S-PPM組的腫瘤細胞數(shù)量明顯少于空白對照組，且細胞呈壞死狀態(tài)，而OCT(Phe)-S-PPM組表現(xiàn)的更明顯，說明OCT(Phe)-S-PPM能提高PPM的體內(nèi)抑瘤活性。以上實驗結(jié)果表明，杠柳次苷偶聯(lián)奧曲肽后其細胞和腫瘤靶向性得到提高，毒性顯著降低，體內(nèi)抑瘤活性增強，為強心甾類固醇活性成分靶向前體藥物關(guān)鍵技術(shù)研究奠定了理論基礎(chǔ)，提供了創(chuàng)新思路和重要參考。
　　第

20、五章氧化-還原感應(yīng)性PEG化長循環(huán)納米前藥的研究
　　本章采用二硫醇二羥基乙酸作為連接劑，將杠柳次苷和維生素E進行偶聯(lián)形成前體藥物。與甲基醚聚乙二醇2000-亞油酸（mPEG2000-LD）混合溶解在乙醇中，通過納米沉淀法制備成氧化還原感應(yīng)性的新型PEG化杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物自組裝納米前藥（MPSSV-NPs）。對該納米前藥進行了表征、穩(wěn)定性和體外釋放研究，對大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)、H22肝癌實體瘤小鼠體內(nèi)組織分布和體內(nèi)抗腫瘤藥效

21、進行了考察。
　　1、新型PEG化杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物自組裝納米前藥（MPSSV-NPs）的制備和表征：以二硫醇二羥基乙酸作為連接劑，合成得到杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物。同時將甲基醚聚乙二醇2000與亞油酸通過酯化反應(yīng)合成得到mPEG2000-LD，采用ESI-MS和NMR對產(chǎn)物進行了表征。結(jié)果證實合成得到了目標(biāo)產(chǎn)物杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物（PPM-S-S-VE）和甲基醚聚乙二醇2000-亞油酸（mPEG2000-LD）。采用納

22、米沉淀法制備了杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物納米前藥（PSSV-NPs）和不同含量mPEG2000-LD修飾的杠柳次苷-維生素E偶聯(lián)物自組裝納米粒前藥（MPSSV-NPs）。以動態(tài)光散射法測定納米粒的粒徑與Zeta電位。結(jié)果顯示，隨著mPEG2000-LD投入量的增加，其粒徑逐漸減少，分散系數(shù)均小于0.2。透射電鏡觀察顯示PSSV-NPs和MPSSV-NPs均呈均勻分散的類球狀物。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，PSSV-NPs在PBS（pH=7.4）介

23、質(zhì)中不穩(wěn)定，而MPSSV-NPs在一個月內(nèi)粒徑無明顯變化。體外釋放實驗結(jié)果顯示，MPSSV-NPs中PPM的釋放和偶聯(lián)物的降解均具有氧化還原感應(yīng)性。
　　2、MPSSV-NPs的藥動學(xué)、組織分布和藥效學(xué)研究：MPSSV-NPs大鼠體內(nèi)生物利用度研究結(jié)果表明，經(jīng)尾靜脈注射給藥后，與原料藥相比，Cmax顯著降低，而Tmax、t1/2和AUC0-24 h均顯著提高，分別提高到8、91.86和21.68倍。與PSSV-NPs相比，Cmax

24、、Tmax、t1/2和AUC0-24 h均顯著提高，分別提高到4.43、2.00、8.99和9.25倍。H22肝癌實體瘤小鼠體內(nèi)組織分布結(jié)果表明，PSSV-NPs和MPSSV-NPs主要分布在肝臟、脾和肺臟器中，且顯著高于PPM。MPSSV-NPs在腫瘤組織的分布顯著高于PSSV-NPs和PPM，而在心臟中分布與PSSV-NPs無顯著差異，顯著低于PPM。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，PPM、PSSV-NPs和MPSSV-NPs組的H22肝癌實體

25、瘤體積均明顯低于空白對照組。MPSSV-NPs對小鼠H22實體瘤的抑制率為66.41%，顯著高于PPM和PSSV-NPs組。病理切片結(jié)果顯示，PPM組心臟組織表現(xiàn)為心肌細胞排列不規(guī)則、心肌纖維化，伴有淋巴細胞浸潤，而PSSV-NPs和MPSSV-NPs組與PBS組無明顯差異型。PPM組的肝組織病理切片表現(xiàn)為肝細胞索變細、肝竇變寬和肝細胞萎縮增多，PSSV-NPs組和MPSSV-NPs組的肝組織病理切片表現(xiàn)輕微肝損傷?？瞻讓φ战M的腫瘤組織

26、表現(xiàn)為腫瘤細胞有絲分裂指數(shù)高、細胞密集和濃染的圓形或者橢圓性泡狀核，PPM組和PSSV-NPs組的腫瘤細胞數(shù)量明顯少于空白對照組，且細胞壞死區(qū)域面積大于對照組，MPSSV-NPs組細胞壞死狀態(tài)明顯，細胞壞死區(qū)域面積大于PPM組和PSSV-NPs組。以上實驗結(jié)果表明，MPSSV-NPs是一種具有氧化還原感應(yīng)性的長循環(huán)納米前藥，顯著延長了PPM體內(nèi)循環(huán)時間、提高了腫瘤組織分布和體內(nèi)抑瘤效果，為PPM的高效低毒和納米化靶向給藥提供了新方法和新