CRMP2對(duì)大鼠缺血再灌注腦損傷后細(xì)胞凋亡及神經(jīng)再生的影響研究.pdf

1、背景及目的：急性缺血性腦卒中患者超早期靜脈溶栓或動(dòng)脈血管機(jī)械開通術(shù)可以恢復(fù)腦血流，避免腦梗死形成，保留神經(jīng)功能。但早期腦缺血再灌注后將引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷腦細(xì)胞，其機(jī)制涉及腦組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等諸多環(huán)節(jié)。最后，由于激活細(xì)胞凋亡基因?qū)е录?xì)胞程序性死亡，使缺血半暗帶區(qū)與梗死區(qū)融合。因此，血管再通也會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷，腦梗死的治療仍然需要神經(jīng)保護(hù)劑的參與。神經(jīng)保護(hù)指在急性缺血性腦卒中的

2、治療中，阻止缺血引起的腦組織一系列的病理生理反應(yīng)，干擾缺血瀑布反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，延長神經(jīng)元存活的藥物或措施。
　　腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（ Collapsin response mediator protein2， CRMP2）是胞質(zhì)磷酸化蛋白CRMP1-5家族的成員之一，該家族參與了神經(jīng)元分化及軸突導(dǎo)向，并在發(fā)育期腦組織中豐富表達(dá)。CRMP2已被證實(shí)在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用，如阿爾茲海默病、精神分裂癥以及腦血管病等。本課題

3、組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CRMP2有利于大鼠缺血再灌注后神經(jīng)軸突的修復(fù)。國內(nèi)外大量研究證實(shí) CRMP2在神經(jīng)修復(fù)、促軸突再生方面的強(qiáng)大作用也顯示了其良好的神經(jīng)保護(hù)潛能。然而，其在腦缺血再灌注損傷后的具體保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。本研究擬通過外源性上調(diào) CRMP2在腦組織中的表達(dá)，探討其對(duì)缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)再生的影響及可能機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：
　　1.健康成年雄性SD大鼠18只，體重250-300g，由重

4、慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為正常組（Normal），對(duì)照組（Control）即單純?nèi)毖俟嘧⒔M，側(cè)腦室加空質(zhì)粒組（LV+VP），海馬加空質(zhì)粒組（H+VP），皮質(zhì)加空質(zhì)粒組（C+VP），嗅球加空質(zhì)粒組（OB+VP），每組n=3，Western blot檢測(cè)各組CRMP2的表達(dá)。
　　2.成年雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為空白質(zhì)粒組（VP）、側(cè)腦室組（LV）、海馬組（H）、皮質(zhì)組（C）及嗅球組（OB），每組 n=20，24h和

5、48h各10只（5只用于GFP檢測(cè)，5只用于Western blot及q-PCR檢測(cè)）。
　　第二部分：
　　1.雄性SD大鼠100只，側(cè)腦室注射1天，制作MCAO/再灌注模型，隨機(jī)分為sham組，MCAO組，MCAO+GFP組，MCAO+CRMP2/GFP組。缺血再灌注48h、1w，Western blot檢測(cè)腦缺血損傷后CRMP2、AIF及NMDAR2B的表達(dá)。TUNEL法檢測(cè)腦缺血損傷后凋亡細(xì)胞。
　　2.熒光定

6、量PCR檢測(cè)各組腦缺血損傷后48h、1w各組大鼠缺血灶周圍腦組織CRMP2、Bcl2、Caspase3、Caspase8及P53的表達(dá)。
　　3.腦缺血再灌注損傷后48h，TTC檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積；48h、1w，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，比較過表達(dá)CRMP2干預(yù)對(duì)腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　第三部分：
　　1.雄性SD大鼠120只，側(cè)腦室注射質(zhì)粒1天后，制作MCAO/再灌注模型，隨機(jī)分為 sha

7、m組， MCAO組， MCAO+GFP組， MCAO+CRMP2/GFP組。缺血再灌注7天免疫熒光檢測(cè)缺血側(cè)皮質(zhì)GFAP及MAP2的表達(dá)。再灌注后5-7天腹腔注射Edu，熒光檢測(cè)SVZ區(qū)及皮質(zhì) Edu標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)；免疫熒光檢測(cè) Nestin/Edu及DCX/Edu標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)。再灌注后14天免疫熒光檢測(cè) GFAP/Edu及MAP2/Edu標(biāo)記的陽性表達(dá)量。
　　2.Western blot檢測(cè)7天、14天BDNF的表達(dá)；免疫

8、組化檢測(cè)7天、14天缺血側(cè)BDNF及NGF的表達(dá)。大鼠灌注取腦前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　海馬和側(cè)腦室注射CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒后24h及48h激光共聚焦結(jié)果顯示：24h側(cè)腦室和海馬的GFP的表達(dá)量均較48h多；不同部位注射 CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒后，皮質(zhì) CRMP2的表達(dá)均有增高，其中側(cè)腦室組及海馬組的轉(zhuǎn)染效率明顯高于皮質(zhì)組及嗅球組（p＜0.01），而側(cè)腦室組比海馬組稍高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯

9、（p＞0.05）
　　第二部分：
　　1.腦缺血損傷后48 h及1 w CRMP2蛋白表達(dá)降低，CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)后，CRMP2的蛋白表達(dá)明顯升高（p＜0.01）。腦缺血再灌注損傷后，缺血灶周圍腦組織TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)量增多，CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)使TUNEL陽性細(xì)胞減少（p＜0.01）。
　　2.腦缺血再灌注48 h及1 w，與sham組比較，缺血再灌注后BCL2的mRNA的表達(dá)水平明顯降低（p＜0.01

10、），而同時(shí)Caspase-3、Caspase-8以及P53的mRNA表達(dá)升高（p＜0.01）；與MCAO及MCAO+GFP組比，真核質(zhì)粒干預(yù)腦缺血組織后升高了BCL2的mRNA水平（p＜0.01），同時(shí)明顯降低了P53、Caspase-3、Caspase-8的mRNA水平（p＜0.01）。與假手術(shù)相比，腦缺血再灌注損傷還使細(xì)胞核AIF蛋白表達(dá)量增加，而過表達(dá)CRMP2使細(xì)胞核AIF表達(dá)量降低（p＜0.01）。
　　3.與sham組

11、相比，48h及1w腦缺血再灌注損傷使NMDAR2B表達(dá)量升高，而過表達(dá)CRMP2降低了其表達(dá)（p＜0.01）。
　　4.再灌注后48 h，MCAO組及MCAO+GFP組大鼠缺血側(cè)可見明顯的梗死灶，并伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損（p＜0.01）；真核質(zhì)粒干預(yù)后梗死灶明顯縮?。╬＜0.01），神經(jīng)功能缺損明顯減輕（p＜0.01）。1 w后，缺血各組大鼠的神經(jīng)功能均有所恢復(fù)，但 MCAO+CRMP2/GFP組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于其他兩組（p

12、＜0.01）。
　　第三部分：
　　1.與sham組相比，再灌注后7天，MCAO組大鼠可見明顯的神經(jīng)元的丟失及大量膠質(zhì)細(xì)胞的激活。MCAO+GFP組大鼠皮質(zhì) MAP2及GFAP的表達(dá)與MCAO組無明顯差異（p＞0.05）。而CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)后， MAP2表達(dá)增多（ p＜0.01）， GFAP的表達(dá)明顯減少（p＜0.01）。
　　2.與假手術(shù)比，腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)了SVZ區(qū)及缺血皮質(zhì)區(qū)Edu標(biāo)記陽性細(xì)胞的表達(dá)（

13、p＜0.05）；而CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)之后Edu在兩個(gè)部位的表達(dá)量較其余三組均增多（ p＜0.05），提示過表達(dá)的CRMP2可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖。免疫熒光雙標(biāo)顯示，缺血再灌注后7d， MCAO組及MCAO+GFP組Nestin與Edu及DCX/Edu的雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多（ p＜0.05），而兩組之間無明顯差異（p＞0.05）。過表達(dá)CRMP2之后Nestin與Edu及DCX/Edu的雙標(biāo)數(shù)量較其余三個(gè)組明顯增多（p＜0.

14、05），提示CRMP2促進(jìn)了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。
　　3.缺血再灌注后14d，MCAO組及 MCAO+GFP組可見明顯的MAP2與Edu雙標(biāo)表達(dá)，CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)組MAP2與Edu雙標(biāo)的表達(dá)量較MCAO組及MCAO+GFP組明顯增多（p＜0.05）；缺血再灌注后14d，CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)組GFAP與Edu雙標(biāo)的表達(dá)量較MCAO組及MCAO+GFP組無明顯差異（p＞0.05）。
　　4.缺血再灌注后7d與

15、14d可見BDNF及NGF的表達(dá)量明顯增多，而過表達(dá)CRMP2使BDNF及NGF的表達(dá)量均進(jìn)一步升高（p＜0.05）。同時(shí)，與MCAO組及MCAO+GFP組相比，過表CRMP2使大鼠神經(jīng)功能缺損明顯減輕（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.CRMP2真核表達(dá)質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染大鼠腦組織，使缺血區(qū)皮質(zhì)CRMP2蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增高。側(cè)腦室的轉(zhuǎn)染效率較其他三個(gè)部位更高。
　　2. CRMP2對(duì)Caspase依賴的線