低表達(dá)FADS1基因可通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的發(fā)展.pdf

1、目的：
　　結(jié)直腸癌是人類常見(jiàn)的消化系統(tǒng)癌癥之一。特別是近幾年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用且過(guò)程復(fù)雜的病理過(guò)程。人口的老齡化，遺傳因素、危險(xiǎn)因素的增加（如肥胖、吸煙、飲酒）以及不利的現(xiàn)代飲食習(xí)慣與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。而脂肪酸代謝作為人體內(nèi)重要的代謝途徑，它與腫瘤的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。多不飽和脂肪酸作為脂肪酸代謝重要的組成部分，它的改變必將會(huì)對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生重大影響。本課題組長(zhǎng)期致

2、力于脂肪酸代謝與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究。課題組前期通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌病人血清樣本的代謝譜分析，發(fā)現(xiàn)與多不飽和脂肪酸代謝相關(guān)的通路出現(xiàn)異常。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲等多方面有影響。本實(shí)驗(yàn)課題為了探究脂肪酸代謝的變化對(duì)結(jié)直腸癌的影響，從脂肪酸的重要組成部分--多不飽和脂肪酸入手，以多不飽和脂肪酸代謝通路關(guān)鍵酶FADS1基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)使FADS1蛋白的表達(dá)下降從而抑制多不飽和脂肪酸的合成，其目的在于觀察FADS1

3、蛋白表達(dá)量的降低對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，以便探尋FADS1基因以及多不飽和脂肪酸在結(jié)直腸癌中的作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新思路。
　　方法：
　　1、使用 life technology公司提供的RNAi功能模塊設(shè)計(jì)兩條 shRNA，進(jìn)行質(zhì)粒重組后，利用含有FADS1shRNA的重組質(zhì)粒對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過(guò)G418的篩選得到FADS1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株。
　　2、將FADS1KD細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)

4、驗(yàn)，分析FADS1KD細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株細(xì)胞功能的差異。
　　（1）利用CCK-8試劑盒測(cè)定FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株的增殖速度，繪制增殖曲線；
　?。?）在六孔板內(nèi)接種少量細(xì)胞，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，檢測(cè)FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的能力；
　　（3）同等條件下觀察FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株對(duì)劃痕的修復(fù)能力；
　?。?）利用Transwell小室測(cè)定FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株的

5、遷移能力；
　　（5）利用基質(zhì)膠模仿細(xì)胞外基質(zhì)，在Transwell小室中測(cè)定FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株的侵襲能力。
　　3、大量培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞，進(jìn)行線粒體提取，再利用超高速離心分離線粒體膜和基質(zhì)，最后利用Glycine-SDS-PAGE電泳技術(shù)來(lái)確定FADS1蛋白在細(xì)胞和線粒體內(nèi)的定位情況。
　　4、在FADS1KD細(xì)胞株密度達(dá)到50-60％時(shí)，進(jìn)行線粒體功能實(shí)驗(yàn)，分析FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株線粒體功

6、能的差異。
　?。?）利用多功能酶標(biāo)儀和ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株線粒體ROS生成量；
　　（2）利用多功能酶標(biāo)儀和TMRM熒光染料檢測(cè)FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株線粒體膜電位水平；
　　（3）利用多功能酶標(biāo)儀和ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株ATP生成量。
　　5、利用Glycine-SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)FADS1KD細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株內(nèi)與線粒體凋亡相關(guān)的

7、蛋白進(jìn)行表達(dá)量的分析，主要檢測(cè)BAX/BCL-XL的變化。
　　6、通過(guò)對(duì)所收集的臨床組織的石蠟切片進(jìn)行免疫染色，根據(jù)染色的深淺來(lái)反應(yīng)FADS1基因在組織中的表達(dá)強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)RNA干擾，兩條shRNA都可以使FADS1KD細(xì)胞株中FADS1的表達(dá)量明顯下降。
　　2、FADS1KD細(xì)胞株中，KD-2增殖速度明顯增加，而KD-1增殖速度無(wú)顯著性差異。3、FADS1KD細(xì)

8、胞株與正常對(duì)照相比，單個(gè)細(xì)胞形成克隆的能力增加，F(xiàn)ADS1KD細(xì)胞株形成的細(xì)胞克隆數(shù)量更多，體積更大。
　　4、FADS1KD細(xì)胞株與正常對(duì)照相比，對(duì)劃痕的修復(fù)能力更強(qiáng)。
　　5、FADS1KD細(xì)胞株無(wú)論是在遷移還是侵襲實(shí)驗(yàn)中，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)都明顯多于正常對(duì)照組。
　　6、提取線粒體后，以正常完整結(jié)直腸癌細(xì)胞為對(duì)照，證明FADS1蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位于線粒體。將單獨(dú)線粒體裂解后，通過(guò)高速離心分離膜和基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)FADS1在

9、線粒體的膜和基質(zhì)中同時(shí)存在。
　　7、FADS1KD細(xì)胞株與正常對(duì)照相比，線粒體內(nèi)的ROS呈顯著性降低。
　　8、FADS1KD細(xì)胞株與正常對(duì)照相比，線粒體膜電位水平、ATP生成量均有所上升。
　　9、在FADS1KD細(xì)胞株中，線粒體凋亡相關(guān)蛋白BAX的表達(dá)量下降而B(niǎo)CL-XL的表達(dá)量上升。
　　10、在結(jié)直腸癌組織石蠟切片中，原發(fā)癌與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ADS1的表達(dá)量下降，而轉(zhuǎn)移癌與原發(fā)癌相比，F(xiàn)ADS1表達(dá)