嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因高效表達(dá)、敲除及工程菌性能研究.pdf

1、嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌是一種嗜酸性專性化能無機(jī)自養(yǎng)菌,是生物冶金工業(yè)中的優(yōu)勢菌種,廣泛應(yīng)用于低品位貧礦的開采冶煉。該菌可以利用業(yè)鐵離子(Fe2+)、硫單質(zhì)(S0)或還原性硫化合物(RISCs)為能源進(jìn)行生長。其中,其鐵代謝研究已相對完善,而硫代謝由于價(jià)態(tài)的多變及非酶學(xué)反應(yīng)的發(fā)生使得研究進(jìn)展緩慢。連四硫酸鹽(S4O62-)是該菌元素硫代謝過程中的一個關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物,也可作為唯一能源物質(zhì),由連四硫酸鹽水解酶催化將其水解為硫酸鹽(SO42-)

2、、硫單質(zhì)(S0)及硫代硫酸鹽(S2O32-)。然而對連四硫酸鹽水解酶的功能及其編碼基因tetH的研究大多集中于生物信息學(xué)預(yù)測,缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持,因而將該基因進(jìn)行無痕敲除,同時構(gòu)建該基因的過表達(dá)工程菌,為探究該基岡的具體功能提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持,也為研究其它硫代謝相關(guān)基因提供方法指導(dǎo)。
　　由于嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的tetH基因在自身啟動子下在大腸桿菌中未見明顯表達(dá),因此,用tac強(qiáng)啟動子代替其自身啟動子在大腸桿菌實(shí)現(xiàn)了異源高效表

3、達(dá),然后亞克隆至廣范圍宿主質(zhì)粒pMSD1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMSD1-tac-tetH,并且通過接合轉(zhuǎn)移將其導(dǎo)入嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌中,構(gòu)建了工程菌At.ferrooxidans ATCC23270(pMS1-tac-tetH)。
　　另一方而,根據(jù)基因同源重組原理,構(gòu)建了對嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌連四硫酸鹽水解酶基因(tetH)進(jìn)行無痕敞除的自殺質(zhì)粒載體pKIT-KtetH,通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌中,在卡那霉素抗性平板上

4、篩選獲得單交換子。之后將表達(dá)I-Scel酶的重組質(zhì)粒pMSD1-I-Scel通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入單交換予中,在鏈霉素抗性平板上篩選獲得接合轉(zhuǎn)移予。根據(jù)二次重組后嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌野生型與tetH基因缺失突變株基因組序列的不同,設(shè)計(jì)相關(guān)引物,通過PCR方法對鏈霉素抗性平板上的單菌落進(jìn)行初篩,并使用Sounhem blot雜交驗(yàn)證獲得的發(fā)生第二次重組的tetH基因敲除突變株。
　　為了研究構(gòu)建的tetH基因高效表達(dá)工程菌及tetH基因缺

5、失突變株硫代謝方面的性質(zhì),以嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌野生型為對照,測定了各菌株在9K-S0液體培養(yǎng)基、9K-K2S4O6液體培養(yǎng)基以及9K-FeSO4液體培養(yǎng)基中的生長,連四硫酸鹽的利用效率,連四硫酸鹽水解酶酶活以及三種培養(yǎng)條件下相關(guān)硫氧化基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,結(jié)果表明(1)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因高效表達(dá)工程菌可以更好地利用硫粉或者連四硫酸鹽進(jìn)行生長,并且在連四硫酸鹽培養(yǎng)基中生長相對野生型明顯提高,但生長總量不及以元素硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)時

6、的生長總量。(2)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因敲除突變株不能利用連四硫酸鹽進(jìn)行生長,但是可以在硫粉為能源物質(zhì)下進(jìn)行生長,且其生長要慢于野生型菌株,證明tetH基因確實(shí)編碼連四硫酸鹽水解酶,而且是該菌唯一能夠代謝連四硫酸鹽的水解酶。tetH基因的缺失并不阻止該菌以硫粉(S0)為能源的生長代謝,分析認(rèn)為可能存在繞過連四硫酸鹽產(chǎn)生的其他途徑。(3)在亞鐵離子為唯一能源下,tetH基因缺失突變株可以生長,且培養(yǎng)物中的Fe2+的濃度降低速率要

7、快于野生型,而tetH基因高效表達(dá)工程菌培養(yǎng)物中的Fe2+的濃度降低速率最慢,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與連四硫酸鹽水解酶具有還原Fe3+為Fe2+的功能相符。(4)不同培養(yǎng)條件下各菌株熒光定量PCR結(jié)果表明tetH基因與doxD2基因的轉(zhuǎn)錄具有協(xié)同性,doxD2基因在硫代硫酸鹽的代謝中起關(guān)鍵作用,并且AFE0267以及AFE1792兩個sqr基因中,首次提出前者在硫化氫代謝中可能起主要作用。為了研究tetH基因缺失后對該菌整個硫代謝網(wǎng)絡(luò)的影響,正在利