兩種白細胞功能異常疾病的臨床分子特征及機制研究.pdf

1、第一部分慢性肉芽腫病患兒臨床與分子特征研究
　　目的：
　　探討26例慢性肉芽腫?。–GD）患兒的臨床特征，實驗室檢查結果及基因突變特征。
　　方法：
　　1．收集2015年6月-2017年2月在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院收治的26例CGD患兒臨床資料和實驗室檢查結果并分析總結。
　　2．流式細胞術分析患兒中性粒細胞呼吸爆發(fā)功能，并計算中性粒細胞氧化指數(shù)NOI（刺激后平均熒光強度/刺激前平均熒光強度）。

2、>　　3．PCR直接測序法分析患兒 CGD相關基因（CYBB、CYBA、NCF1、NCF2）。
　　結果：
　　1．一般情況：26例患兒均為男性，15例（57.7%）來自我國西南地區(qū)，平均起病年齡2.3月，平均診斷年齡1.4歲，14例（53.8%）有家族史（男性親屬早年夭折）。
　　2．臨床表現(xiàn)：26例患兒均有反復發(fā)熱，肺炎（24例，92.3%）、腹瀉（13例，50%）、皮膚黏膜及皮下組織感染（14例，53.8%）、肝

3、脾腫大、肝功能異常（12例，46.2%）為本組患兒最常見的臨床表現(xiàn)。21例接種卡介苗的患兒中14例（66.7%）發(fā)生BCG接種異常反應（卡疤化膿、BCG淋巴結炎、肺結核）。此外，3例（11.5%）發(fā)生肝膿腫，2例（7.7%）?；寄蚵犯腥?br>　　3．實驗室檢查：本組患兒多出現(xiàn)外周血白細胞總數(shù)增高，以中性粒細胞為主，多有CRP增高。淋巴細胞分類未見明顯異常，免疫球蛋白正?；虼鷥斝栽龈?，其中9例（34.6%）出現(xiàn)IgE明顯增高。除2例患兒

4、NBT正常外，其余21例（80.8%）NBT均明顯降低，多數(shù)PMA刺激后為0。僅50%患兒找到致病病原菌。
　　4．呼吸爆發(fā)試驗及基因突變分析：患兒 NOI多數(shù)低于2（1.365±0.1018），明顯低于正常值（正常人>100），患兒母親 NOI正?；虻陀谡Ｖ?；21例（80.8%）患兒發(fā)現(xiàn) CYBB基因突變，1例（3.8%） CYBA突變，4例（15.4%）尚未明確致病基因，發(fā)現(xiàn)15名XLR-CGD攜帶者。
　　結論:

5、r>　　CGD患兒多于生后即發(fā)生嚴重的細菌及真菌感染，患兒伴有BCG接種異常反應及男性親屬早年夭折家族史，白細胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細胞為主，NBT異常，免疫球蛋白正?；蛏撸瑒t需警惕CGD。流式細胞術檢測中性粒細胞呼吸爆發(fā)功能可快速診斷CGD，基因檢測可進一步確診患者、發(fā)現(xiàn)攜帶者，有產(chǎn)前診斷意義。
　　第二部分慢性肉芽腫病患兒記憶B細胞減少的相關因素研究
　　目的:
　　探討CGD患兒是否存在外周血記憶B細胞（MB

6、C）減少的現(xiàn)象，尋找其減少的原因；并探索IFN-γ治療CGD患兒，減少反復感染的可能機制，為臨床運用IFN-γ治療和預防反復感染提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1．流式細胞術檢測 CGD患兒 MBC百分比、CD4+T細胞表面CD40L表達量、Tfh細胞及其表面PD-1百分比。
　　2．不同濃度 sCD40L（1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml）與正常兒童外周血PBMC共同刺激培養(yǎng)24h、36h、48h，流式細

7、胞術檢測MBC數(shù)量的變化。
　　3．分別用不同濃度的外源性H2O2（10μmol/L、30μmol/L）、IFN-γ（2000U/ml、3000U/ml）與 CGD患兒外周血 PBMC共同刺激培養(yǎng)24h，流式細胞術檢測MBC數(shù)量的變化。
　　結果:
　　1．CGD患兒 MBC百分比(1.267%±0.1416%)較健康對照兒童（2.824%±0.27%）明顯降低（P＜0.0001）。
　　2．CGD患兒CD4+T

8、細胞表面CD40L百分比（8.186%±2.736%）較健康對照兒童（46.43%±4.619%）明顯降低（P＜0.0001）。
　　3．CGD患兒外周血 Tfh細胞(5.625%±0.5005%)與健康兒童(6.269%±1.177%)無顯著差異(P=0.5614)。PD-1百分比（9.039%±1.984%）與健康兒童（18.26%±10.11%）無顯著差異(P=0.7546)。
　　4．外源性補充sCD40L不能促進健

9、康兒童MBC增高，MBC百分比隨培養(yǎng)時間延長逐漸降低（P=0.0028）。
　　5．外源性補充H2O2、IFN-γ對CGD患兒MBC無明顯刺激作用，相反，MBC百分比隨培養(yǎng)時間延長逐漸降低（P＜0.0001）。
　　結論:
　　CGD患兒外周血MBC減少可能是患兒反復感染的原因，MBC減少可能與CD4+T細胞表面CD40L表達減少相關，雖然CGD患兒外周血Tfh細胞數(shù)量正常，但仍需進一步分析Tfh細胞表面CD40L表達

10、情況以明確Tfh細胞功能是否正常。IFN-γ并不通過刺激CGD患兒外周血MBC增殖發(fā)揮治療作用。
　　第三部分3例白細胞黏附分子缺陷病Ι型的臨床及分子特征分析
　　目的:
　　探討3例白細胞黏附分子缺陷病Ι型（LAD-1）患兒的臨床特征和CD18蛋白表達異常及基因突變特征。
　　方法:
　　1．總結3例患兒臨床資料，常規(guī)免疫學篩查除外常見原發(fā)性免疫缺陷病。
　　2．流式細胞術檢測白細胞表面CD18分子

11、。
　　3．PCR測序分析患兒及其父母ITGB2基因。
　　結果:
　　1．臨床表現(xiàn)：患兒均自新生兒起以臍炎起病，之后經(jīng)歷反復皮膚黏膜及軟組織感染（肺炎、中耳炎、鵝口瘡、牙齦炎伴乳牙早脫），其中2例（例1、例2）有臍帶脫落延遲史（>21天），2例（例1、例3）有慢性皮膚感染及傷口愈合延遲（>1月），1例（例1）家族中有早年夭折患兒。
　　2．實驗室檢查：患兒均有外周血白細胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細胞為主，因反復感

12、染，常伴有貧血，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM增高，淋巴細胞分類、NBT無明顯異常。
　　3．CD18流式分析：患兒白細胞表面 CD18分子表達明顯降低，例2為重度缺陷（CD18在淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞上分別為0、0.23%、0），例1、例3為中度缺陷（例1：9.49%、0.04%、0.45%；例3：10.14%、0.67%、2.54%），但所有父母CD18表達均>90%。
　　4． ITGB2基因分析：發(fā)現(xiàn)5種突

13、變位點（c.167_168insGG、c.1884C>A、c.533C>T、c.817G>C、c.1768T>C），其中2種為新型突變（例1 c.167-168insGG、c.1884C>A），并發(fā)現(xiàn)5名攜帶者。
　　結論:
　　自幼反復嚴重皮膚黏膜及軟組織感染，尤其伴有臍炎、臍帶脫落延遲，傷口愈合延遲，反復牙齦炎伴乳牙早脫，白細胞總數(shù)顯著增高，以中性粒細胞為主，伴免疫球蛋白正?；蛏叩幕純盒杈?LAD-1。流式細胞術檢測