自噬對(duì)缺氧誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和梗死后心肌纖維化的調(diào)控及機(jī)制.pdf

1、第一部分自噬對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)及機(jī)制
　　目的：
　　1、研究缺氧對(duì)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ human cardiac microvascular endothelial cells，HCMECs）間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（endothelial-to-mesenchymal transition， EndMT）及自噬的影響；
　　2、研究自噬對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HCMECs EndMT的影響及具體機(jī)制。

2、　　方法：
　　1、探究缺氧狀態(tài)下對(duì) HCMECs EndMT的影響。實(shí)驗(yàn)主要分為2組①control組：常氧（21％O2、5%CO2、74%N2，37℃）條件下培養(yǎng) HCMECs3天；②hypoxia組：缺氧（1%O2、5%CO2、74%N2，37℃）條件下培養(yǎng) HCMECs3天，分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：⑴光學(xué)顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；⑵RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞中 CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1及

3、Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平；⑶Western blot測(cè)定兩組細(xì)胞CD31、E-Cadherin、ɑSMA、FSP-1、Snail蛋白表達(dá)水平；⑷雙重免疫熒光染色觀察 CD31、αSMA及FSP-1表達(dá)變化及并對(duì)CD31＋αSMA＋/FSP+雙陽(yáng)性細(xì)胞（說(shuō)明正在發(fā)生EndMT的細(xì)胞）和CD31-SMA＋/FSP+細(xì)胞(說(shuō)明已經(jīng)發(fā)生EndMT的細(xì)胞）計(jì)數(shù)分析。
　　2、探究缺氧狀態(tài)下HCMECs自噬水平的變化。⑴HCMECs缺

4、氧3天內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)Western blot法測(cè)定HCMECs缺氧0，2，4，6，12，24，48，72 h處LC3表達(dá)變化；⑵將細(xì)胞分為以下4組：①control組：常氧條件下培養(yǎng) HCMECs；②氯喹(Chloroquine，CQ)(20μm)組：常氧條件下加入氯喹處理 HCMECs8小時(shí)；③hypoxia組：缺氧條件下培養(yǎng) HCMECs6小時(shí)；④hypoxia+CQ(20μm)組：常氧條件用氯喹處理HCMECs2

5、小時(shí)，缺氧培養(yǎng)6小時(shí)；Western blot法分別測(cè)定各組 LC3表達(dá)變化；⑶轉(zhuǎn)染 GFP-LC3質(zhì)粒的HCMECs在缺氧3天內(nèi)GFP-LC3表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)激光共聚焦觀察HCMECs缺氧0，2，6，12，24，36，48，72 h處GFP-LC3表達(dá)變化。
　　3、探究缺氧狀態(tài)下自噬對(duì)HCMECs EndMT的影響及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要分為以下5組①control組：常氧條件下培養(yǎng) HCMECs3天；②hypoxia組：缺氧條

6、件下培養(yǎng) HCMECs3天；③hypoxia+雷帕霉素（rapmycin，rap)(100nm）組：雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，后將 HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天；④hypoxia+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA)(5mm)組：3-MA預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天；⑤hypoxia+CQ(20μm)組：氯喹預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天。分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)

7、行如下實(shí)驗(yàn)：⑴雙重免疫熒光染色觀察CD31及αSMA表達(dá)變化并對(duì)CD31＋αSMA＋雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD31-SMA＋細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；激光共聚焦顯微鏡下觀察Snail及 LC3在 HCMECs的共定位；⑵RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞中 CD31、E-Cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、TGFβ2、Smad2及Smad3的 mRNA表達(dá)水平并比較分析；⑶Western blot測(cè)定各組細(xì)胞中CD31、E-cadherin、αSMA、

8、FSP-1、Snail、LC3、beclin1、TGFβ2、Smad2、p-Smad2、Smad3及p-Smad3蛋白表達(dá)并比較分析。
　　結(jié)果：
　　1、缺氧誘導(dǎo) HCMECs發(fā)生EndMT：
　?、殴鈱W(xué)顯微鏡可見(jiàn)：control組HCMECs保持典型的鋪路石或鵝卵石樣內(nèi)皮細(xì)胞樣外觀；而缺氧狀態(tài)下細(xì)胞逐漸呈紡錘型樣變化，且隨時(shí)間變化愈明顯。
　?、芌T-PCR結(jié)果顯示：與control組相比，hypoxia組

9、HCMECs的CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)下降，而αSMA、FSP-1及Snail mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。
　?、荳estern blot結(jié)果顯示：與control組相比，hypoxia組 HCMECs的CD31、E-cadherin蛋白表達(dá)下降，而αSMA、FSP-1及Snail蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。
　?、入p重免疫熒光染色結(jié)果顯示：與control組相比，hypoxia組 HCMECs

10、中CD31表達(dá)逐漸減弱，αSMA/FSP-1強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，CD31＋αSMA＋/FSP+雙陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加甚至出現(xiàn)CD31-SMA＋/FSP+細(xì)胞（P＜0.05）。
　　2、缺氧誘導(dǎo) HCMECs發(fā)生EndMT：
　?、臰estern blot結(jié)果顯示：當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時(shí)，在4小時(shí)處LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增加，12至24小時(shí)達(dá)高峰，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)略有下降（P＜0.05）。
　?、苭estern blo

11、t結(jié)果示：相比于control組，hypoxia組和CQ組LC3 II增加，氯喹使缺氧狀態(tài)下LC3 II增加更顯著（P＜0.05）。
　?、荊FP-LC3斑點(diǎn)聚集試驗(yàn)結(jié)果示：當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時(shí)，GFP-LC3熒光表達(dá)在約4-6小時(shí)開(kāi)始開(kāi)始由彌撒分布向聚集顆粒狀轉(zhuǎn)變，12小時(shí)至24小時(shí)這種聚集狀態(tài)升至高峰，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)這種聚集改變下降，但仍高于對(duì)照組水平（P＜0.05）。
　　3、缺氧狀態(tài)下自噬對(duì)HCMECs E

12、ndMT的影響及相關(guān)機(jī)制：
　　⑴雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示：相比hypoxia組，hypoxia+rap組CD31表達(dá)強(qiáng)度增加，αSMA表達(dá)強(qiáng)度下降，而hypoxia+3-MA/CQ組CD31表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步下調(diào)，αSMA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步增加。相比control組，hypoxia組Snail和LC3表達(dá)強(qiáng)度增加；相比hypoxia組，hypoxia+rap組LC3表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步增加和Snail表達(dá)強(qiáng)度下降，hypoxia+3-MA組L

13、C3表達(dá)強(qiáng)度下降和Snail表達(dá)強(qiáng)度增加， hypoxia+CQ組LC3和Snail表達(dá)強(qiáng)度都進(jìn)一步增加（P＜0.05）。
　?、芌T-PCR結(jié)果顯示：相比hypoxia組，hypoxia+rap組TGFβ2、smad2、smad3及 Snail mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào)，αSMA、FSP-1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），hypoxia+3-MA/CQ組TGFβ2、smad2、smad

14、3及 Snail mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)下降，αSMA、FSP-1表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。
　?、荳estern blot結(jié)果顯示：雷帕霉素增加了缺氧狀態(tài)下自噬相關(guān)蛋白LC3， beclin1的表達(dá)，抑制了缺氧誘導(dǎo)的CD31、E-cadherin的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào)，3-MA和氯喹抑制了缺氧狀態(tài)下自噬的發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)了缺氧引起的CD31、E-cadher

15、in的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào)（P＜0.05）。缺氧狀態(tài)下，TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；相比hypoxia組，缺氧聯(lián)合雷怕霉素、3-MA或氯喹后TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達(dá)均未見(jiàn)明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1、缺氧能同時(shí)誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生EndMT及自噬；
　　2、缺氧可通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路引起EndMT；
　　3、缺氧誘導(dǎo)的自

16、噬對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)性作用，可通過(guò)促進(jìn)Snail降解抑制EndMT。
　　第二部分自噬對(duì)心肌梗死后EndMT及心肌纖維化的調(diào)節(jié)及機(jī)制
　　目的：
　　探討在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI)后，通過(guò)干預(yù)自噬水平抑制EndMT進(jìn)而減少心肌纖維化的的可行性。
　　方法：
　　取10周齡SD大鼠隨機(jī)分為以下4組①Sham組：不對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理，余處理同A

17、MI組；②AMI組：對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理；③AMI+rap（2 mg/kg/day）：對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理，隨即腹腔注射雷帕霉素，每天一次，持續(xù)14天；④AMI+3-MA（15 mg/kg/day）：對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理，隨即腹腔注射3-MA，每天一次，持續(xù)14天；分別對(duì)各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：⑴心肌梗死14天后心臟彩超觀察各組大鼠LVEF、LVFS、LVIDd及LVIDs變化并比較分析；⑵心

18、肌梗死14天后Masson’s trichrome染色檢測(cè)各組大鼠心肌膠原纖維化面積并比較分析；⑶心肌梗死7天后Western blot測(cè)定各組大鼠左室心肌梗死區(qū)域CD31、αSMA、COL1、LC3、beclin1的表達(dá)水平及比較分析；⑷心肌梗死7天后對(duì)左室心肌梗死區(qū)域雙重免疫熒光染色觀察CD31＋αSMA＋雙陽(yáng)性細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞LC3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?、糯笫笮呐K彩超結(jié)果顯示：SD大鼠心肌梗死14天后，LVI

19、Dd、LVIDs擴(kuò)大， LVEF、LVFS減低；雷帕霉素抑制心肌梗死后LVIDd、LVIDs的擴(kuò)大及LVEF、LVFS減低（P＜0.05）；3-MA并不能改善心肌梗死后心功能。
　?、芃asson’s trichrome染色結(jié)果顯示：SD大鼠心肌梗死14天后，左室梗死區(qū)域纖維化顯著；雷帕霉素顯著減少心肌梗死后心肌纖維化面積；3-MA顯著增加心肌梗死后心肌纖維化面積（P＜0.05）。
　　⑶左室心肌梗死區(qū)域western bl

20、ot結(jié)果顯示：LC3-II在心肌梗死后1天內(nèi)顯著上升，而后表達(dá)逐漸減低；心肌梗死7天后，CD31表達(dá)下降，αSMA、COL1表達(dá)增加，LC3、beclin1未見(jiàn)明顯改變；雷帕霉素增加了LC3及beclin1的表達(dá)，顯著抑制了心肌梗死后的CD31表達(dá)下降和αSMA、COL1表達(dá)增加；3-MA降低了LC3及beclin1的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了心肌梗死后的CD31表達(dá)下降和αSMA、COL1表達(dá)增加（P＜0.05）。
　?、茸笫倚募」Ｋ绤^(qū)

21、域雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示：CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞在心肌梗死后第7天明顯上升，雷帕霉素可明顯減少心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞，3-MA可增加心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞（P＜0.05）；心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)變化改變不明顯，雷帕霉素可增加心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)水平，3-MA可減低心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)水平（P＜0.05）。
　　結(jié)論：