早期預(yù)測葡萄胎惡變的組織學(xué)標(biāo)志物研究.pdf

1、本研究共分為兩部分。第一部分為臨床病例資料分析，探討葡萄胎惡變的臨床特征及危險(xiǎn)因素，并量化評價(jià)各危險(xiǎn)因素對葡萄胎惡變的預(yù)測價(jià)值，尋找能預(yù)測葡萄胎惡變的臨床指標(biāo)。第二部分是通過免疫組織化學(xué)法檢測葡萄胎首次清宮石蠟標(biāo)本中PAK1、E-CD、p53、eIF3a和MMP-9蛋白的表達(dá)情況，分析其對葡萄胎惡變的預(yù)測價(jià)值，探討葡萄胎惡變的機(jī)制，為腦轉(zhuǎn)移或耐藥性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤提供新的治療思路。
　　第一部分葡萄胎惡變的危險(xiǎn)因素及臨床特征分析<

2、br>　　背景：
　　葡萄胎是一種良性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，但有惡變傾向;類型不同，其惡變發(fā)生率也不同。部分性葡萄胎惡變發(fā)生率為4％，完全性葡萄胎惡變發(fā)生率為15％。臨床上對葡萄胎惡變?yōu)槿焉镒甜B(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷主要依據(jù)血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平的測定，而盆腔超聲、X線胸片、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)和磁共振檢查等影像學(xué)證據(jù)則作為非

3、必需的診斷依據(jù)。臨床實(shí)踐中，從葡萄胎首次清宮到隨訪發(fā)現(xiàn)血清hCG水平異常升高并診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤通常需要一定的時(shí)間，導(dǎo)致葡萄胎惡變的診斷往往滯后于病情的進(jìn)展，患者難以獲得早期治療的機(jī)會。因此臨床上迫切需要進(jìn)一步篩選葡萄胎惡變的高危因素及早期預(yù)警指標(biāo)，為葡萄胎惡變的早期診斷、早期治療提供依據(jù)。目前完全性葡萄胎惡變的高危因素可能包括:hCG＞105U/L，子宮明顯大于相應(yīng)孕周，卵巢黃素化囊腫直徑＞6cm，年齡＞40歲，重復(fù)葡萄胎，合并嚴(yán)

4、重的妊娠期高血壓或甲狀腺功能亢進(jìn)癥。但這些高危因素對預(yù)測葡萄胎惡變的價(jià)值存在不確定性，不足以指導(dǎo)葡萄胎患者的預(yù)防性化療。因此，如何早期預(yù)測及診斷葡萄胎惡變已經(jīng)成為目前臨床急需解決的問題。
　　目的：
　　探討葡萄胎惡變的臨床特征及危險(xiǎn)因素，并量化評價(jià)各危險(xiǎn)因素對葡萄胎惡變的預(yù)測價(jià)值，尋找能預(yù)測葡萄胎惡變的臨床指標(biāo)。
　　方法：
　　回顧性分析2010年1月至2014年6月在臨沂市人民醫(yī)院治療及隨訪的葡萄胎病例資料

5、，其中71例隨訪期間發(fā)生惡變，為葡萄胎惡變組;另隨機(jī)取77例隨訪2年未發(fā)生惡變者，為葡萄胎組。
　　分析指標(biāo)包括患者的年齡、孕周、子宮大小、首次清宮時(shí)葡萄胎病變的體積、首次清宮時(shí)超聲測量葡萄胎病變3條徑線的平均值、首次清宮時(shí)血清β-hCG值、滋養(yǎng)細(xì)胞增生程度、卵巢黃素化囊腫、首次清宮到診斷妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的時(shí)間（天）、葡萄胎惡變的臨床特征。
　　統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS(statistical package for socia

6、l science，SPSS)24.0軟件，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組間率的比較采用x2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布或等級資料的比較采用秩和檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析，危險(xiǎn)因素對葡萄胎惡變的預(yù)測價(jià)值采用ROC曲線分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　年齡:年齡＞40歲，葡萄胎惡變組(39.44％)明顯多于葡萄胎組(20.78％)，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=6.155，P=0.013＜0.05）。年

7、齡≥35歲，葡萄胎惡變組(47.89％)明顯多于葡萄胎組(24.68％)，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=8.658，P=0.003＜0.01);但在葡萄胎惡變組，年齡＜35歲的有37例，占52.11％。
　　孕周:孕周≥12周，葡萄胎惡變組(29.58％)略多于葡萄胎組(20.78％)，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=1.525，P=0.217＞0.05）。
　　子宮大小:子宮明顯大于相應(yīng)孕周，葡萄胎組(45.45％)略多于葡萄胎惡變

8、組(40.85％)，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=0.32，P=0.572＞0.05）。
　　葡萄胎官腔病變體積:葡萄胎組病變體積的平均值為307619.75±476989.456mm3，葡萄胎惡變組的病變體積平均值為467764.25±929271.77mm3。葡萄胎惡變組病變的平均體積大于葡萄胎組，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.299，P=0.196＞0.05)。
　　葡萄胎官腔病變3條徑線的平均值:當(dāng)葡萄胎宮腔病變徑線平均

9、值≥6cm時(shí)，葡萄胎惡變組(69.01％)明顯多于葡萄胎組(37.66％)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=14.566，P=0.000＜0.01）。在所有的葡萄胎中，病變徑線平均值≥6cm的共有78例，其中惡變的葡萄胎49例，占62.82％，未惡變的29例，占37.18％。
　　首次清官時(shí)血清β-hCG測定值:血清β-hCG測定值＞105 mIU/ml，葡萄胎組(76.62％)低于葡萄胎惡變組(85.92％)，二者比較，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、(x2=2.079，P=0.149＞0.05)。
　　二次清官:葡萄胎組有49例實(shí)施了二次清宮術(shù)，占63.64％;葡萄胎惡變組有40例實(shí)施了二次清宮術(shù)，占56.34％。葡萄胎組和葡萄胎惡變組的二次清宮率比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=0.821，P=0.365＞0.05)。
　　滋養(yǎng)細(xì)胞增生程度:葡萄胎組與惡變組滋養(yǎng)細(xì)胞輕度增生情況的比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=1.189，P=0.272＞0.05）;根據(jù)滋養(yǎng)細(xì)胞的增生程度分為輕

11、、中、重3個(gè)等級，通過秩和檢驗(yàn)了解葡萄胎發(fā)生惡變與滋養(yǎng)細(xì)胞增生程度的關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量為-1.065，也無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.2875＞0.05）。
　　卵巢黃素化囊腫:無黃素化囊腫所占比例的比較，葡萄胎組(89.61％)多于惡變組(74.65％)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=5.711，P=0.017＜0.05），說明有卵巢黃素化囊腫的葡萄胎惡變的可能性更大。卵巢黃素化囊腫直徑＞6cm所占的比例比較，葡萄胎組(2.6％)明顯

12、低于惡變組(11.27％)，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=4.407，P=0.036＜0.05)，說明卵巢黃素化囊腫直徑＞6cm為葡萄胎惡變的高危因素。但無論惡變還是未發(fā)生惡變的葡萄胎，大部分都沒有囊腫(122/148，82.43％)，且黃素化囊腫直徑＞6cm的例數(shù)較少，所以其對預(yù)測葡萄胎惡變?nèi)狈γ舾行裕荒苡行У仡A(yù)測葡萄胎惡變。
　　二元Logistic回歸分析:年齡≥35歲為葡萄胎惡變的高危因素(OR=3.06，P=0.004＜0

13、.01，95％CI:1.427～6.561);超聲測量葡萄胎宮腔病變3條徑線的平均值≥6cm，為葡萄胎惡變的危險(xiǎn)因素(OR=4.514，P=0.001＜0.01，95％CI:1.909～10.67);卵巢黃素化囊腫直徑＞6cm，為葡萄胎惡變的高危因素(OR=2.188，P=0.039＜0.05,95％CI:1.038～4.611)。
　　葡萄胎惡變的診斷時(shí)間及臨床特征:在葡萄胎惡變組，有65例在首次清宮后60天內(nèi)被診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)

14、胞腫瘤，占84.42％。葡萄胎惡變者的血清β-hCG水平一定會異常升高;當(dāng)葡萄胎患者被診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤時(shí)，大約有1/3以上的葡萄胎惡變者存在明顯的超聲可見的子宮肌層病變;大約有1/4的葡萄胎惡變者存在CT或X線胸片能發(fā)現(xiàn)的肺部轉(zhuǎn)移病灶。
　　相關(guān)分析和ROC曲線分析:葡萄胎惡變組宮腔病變3條徑線的平均值與首次清宮后發(fā)現(xiàn)葡萄胎惡變診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的天數(shù)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.333，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。年

15、齡和葡萄胎宮腔病變3條徑線平均值的ROC曲線下的面積都介于0.5～0.7之間，說明其對預(yù)測葡萄胎惡變的準(zhǔn)確性較低;而卵巢黃素化囊腫不能預(yù)測葡萄胎惡變。
　　結(jié)論：
　　1.年齡≥35歲、葡萄胎宮腔病變徑線的平均值≥6cm、卵巢黃素化囊腫直徑＞6cm是葡萄胎惡變的高危因素。
　　2.血清β-hCG測定值＞105mIU/ml、孕周≥12周、子宮明顯大于相應(yīng)孕周、滋養(yǎng)細(xì)胞增生程度、二次清宮操作都與葡萄胎惡變無關(guān)。
　　

16、3.大部分(84.42％)葡萄胎惡變會在首次清宮后60天內(nèi)被診斷，此時(shí)約64.79％的病例已經(jīng)存在局部子宮肌層浸潤或肺部轉(zhuǎn)移病灶。
　　第二部分 PAK1、E-CD、p53、eIF3a和MMP-9對葡萄胎惡變的預(yù)測價(jià)值
　　背景：
　　葡萄胎是一種來源于胚胎外層胎盤絨毛的良性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，主要表現(xiàn)為滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生變性、絨毛水腫，從而形成水泡狀物，大多可以通過清宮治愈;但有潛在惡變的傾向，部分病例可惡變?yōu)槿焉镒甜B(yǎng)細(xì)胞腫瘤，

17、其惡變發(fā)生率約為10％～20％。葡萄胎發(fā)生惡變的原因尚不清楚，一般認(rèn)為是同一種疾病的不同發(fā)展階段;其分子機(jī)制也不清楚，還處于探索階段。有報(bào)道葡萄胎是雄核發(fā)育，缺乏母源基因引起基因組不平衡，從而改變了基因的表達(dá)活動，最終發(fā)生惡變。正常妊娠時(shí)，胎盤絨毛的滋養(yǎng)細(xì)胞均具有侵蝕母體子宮內(nèi)膜組織的能力，但母體組織能對抗其侵蝕，使侵蝕受到一定程度的限制;而葡萄胎滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕能力明顯增強(qiáng)，因而具有惡變傾向。
　　病理學(xué)對葡萄胎惡變的診斷往往需要

18、在切除的子宮標(biāo)本的肌層或血管中見到絨毛浸潤，而子宮切除術(shù)顯然并不是常規(guī)的治療手段?？梢?，若沒有子宮標(biāo)本，病理學(xué)家很難做出葡萄胎惡變的診斷。由于缺乏病理組織學(xué)依據(jù)，目前臨床上對葡萄胎惡變?yōu)槿焉镒甜B(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷主要依據(jù)清宮后隨訪人絨毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotropin，hCG)水平，致使診斷明顯滯后于病情發(fā)展。葡萄胎惡變后具有強(qiáng)大的破壞力，很早便可通過血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，若能早期發(fā)現(xiàn)葡萄胎惡變并給予化療，不僅預(yù)

19、后會更好，還可以降低初始單一化療產(chǎn)生的耐藥和降低聯(lián)合化療的可能性。
　　于是，研究者們紛紛探索能預(yù)測葡萄胎惡變的方法。p57為父源性印記基因的母源性表達(dá)，在完全性葡萄胎大部分為陰性表達(dá)，在部分性葡萄胎中幾乎都為陽性表達(dá)，可以很好的鑒別完全性葡萄胎和部分性葡萄胎。完全性葡萄胎比部分性葡萄胎惡變的傾向大，其惡變率大約在20％左右，雖然蛋白p57可以鑒別出完全性葡萄胎，但對葡萄胎惡變的預(yù)測方面能力有限。
　　如何及時(shí)準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)葡萄

20、胎惡變或在惡變之前就能預(yù)測，有的放矢的給予預(yù)防性化療，是目前臨床急需解決的問題。
　　目的：
　　探索與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的蛋白p21活化激酶1(p21-activated protein kinase1，PAK1)、上皮型鈣粘附素（epithelial cadherin，E-CD）、p53、真核細(xì)胞起始因子a亞單位(eukaryotic initiation factor3 a，eIF3a)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matri

21、xmetalloproteinase-9，MMP-9)對預(yù)測葡萄胎惡變的價(jià)值。
　　方法：
　　石蠟包埋組織標(biāo)本來源于論文第一部分中2010年1月至2014年6月在臨沂市人民醫(yī)院住院治療的90例葡萄胎患者的首次清宮標(biāo)本的石蠟塊，其中50例為隨訪期間發(fā)生惡變的葡萄胎（除外首次清宮后1周內(nèi)診斷為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的病例），為葡萄胎惡變組;40例為隨訪2年未發(fā)生惡變的葡萄胎，為葡萄胎組。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為葡萄胎，復(fù)習(xí)原切片

22、，選擇滋養(yǎng)細(xì)胞明顯的蠟塊;所選病例都有完整的臨床病理資料，清宮前都未接受化療。采用免疫組織化學(xué)法檢測PAK1、E-CD、p53、eIF3a和MMP-9的表達(dá)。
　　采用雙盲法，每張切片觀察5個(gè)以上高倍鏡視野（40倍），PAK1、eIF3a和MMP-9以滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性;p53以滋養(yǎng)細(xì)胞核出現(xiàn)界限清楚的棕黃色顆粒為陽性;E-ED以滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比、染色強(qiáng)度和免疫組

23、化半定量評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。根據(jù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞的染色深度分為:陰性細(xì)胞0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;再根據(jù)染色面積進(jìn)行評分:0分染色面積為0％～25％，1分為26％～50％，2分為51％～75％，3分為76％～100％。根據(jù)兩者的乘積，進(jìn)行陽性等級判斷。PAK1、MMP-9和p53陽性等級判斷:0分為陰性（一），1～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等強(qiáng)度陽性反應(yīng)(++)，6分及以上為強(qiáng)陽性反應(yīng)(+++)。因PAK1蛋白在正常

24、乳腺小葉組織的表達(dá)的乘積分都未超過3分，所以設(shè)定染色0～3分為PAK1正常表達(dá)，＞3分為過度表達(dá)。
　　E-ED和eIF3a陽性等級判斷:0分為陰性（－），1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等強(qiáng)度陽性反應(yīng)(++)，6分以上為強(qiáng)陽性反應(yīng)(+++)。E-CD都在細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙中表達(dá)，所有細(xì)胞都呈陽性反應(yīng)為正常，即強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)為正常表達(dá)，其余為異常表達(dá)。
　　所得的數(shù)據(jù)采用SPSS(statistical packag

25、e for social science，SPSS)24.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間率的比較采用x2檢驗(yàn)，各指標(biāo)之間的關(guān)系采用相關(guān)分析，各指標(biāo)的特異性及敏感度采用ROC曲線分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　PAK1:PAK1過度表達(dá)，葡萄胎惡變組(62％)高于葡萄胎組(17.5％)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=18.039，P=0.000＜0.01）。在90例葡萄胎組織中，PAK1過度表達(dá)38例，其中31例

26、為葡萄胎惡變組，占81.58％，說明若PAK1過度表達(dá)，對葡萄胎發(fā)生惡變的陽性預(yù)測值高達(dá)81.58％。
　　E-CD: E-CD的陽性表達(dá)，葡萄胎惡變組(98％)高于葡萄胎組(85％)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=5.236，P=0.022＜0.05）。E-CD在葡萄胎惡變組中等強(qiáng)度及以上陽性表達(dá)(90％)高于葡萄胎組(62.5％)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=9.723，P=0.002＜0.01)。E-CD在葡萄胎惡變組異常表達(dá)(82％

27、)和葡萄胎組的異常表達(dá)(82.5％)比較，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=0.004，P=0.951＞0.05）。
　　p53:p53在葡萄胎惡變組中陽性表達(dá)率(90％)高于葡萄胎組(67.5％)，二者比較，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=7.031，P=0.008＜0.01）。p53在葡萄胎惡變組中等及以上強(qiáng)度陽性表達(dá)(28％)高于葡萄胎組(15％)，二者比較，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=2.173，P=0.14＞0.05）。
　　eIF3

28、a: eIF3a在葡萄胎組中陽性表達(dá)(92.5％)與葡萄胎惡變組的陽性表達(dá)(92％)比較，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=0.008，P=0.93＞0.05）;兩組中eIF3a的中等強(qiáng)度及以上陽性表達(dá)率比較，葡萄胎惡變組(64％)高于葡萄胎組(52.5％)，也無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=1.214，P=0.271＞0.05）。
　　MMP-9:MMP-9在葡萄胎惡變組中陽性表達(dá)(58％)高于葡萄胎組(42.5％)，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=2.

29、137，P=0.144＞0.05）。
　　相關(guān)分析和ROC曲線分析:p53和eIF3a的表達(dá)與PAK1、E-CD、MMP-9都呈顯著正相關(guān)，p53和eIF3a的表達(dá)也呈正相關(guān)。PAK1的ROC曲線下的面積(areaunder curve，AUC)介于0.7～0.9之間，對預(yù)測葡萄胎惡變具有一定的準(zhǔn)確性;p53和MMP-9的AUC雖有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其值都介于0.5～0.7之間，預(yù)測葡萄胎惡變的準(zhǔn)確性較低。
　　結(jié)論：