腫瘤壞死因子α對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌mRNA表達(dá)譜的影響及通過(guò)抑制TRPP2的表達(dá)促進(jìn)人喉鱗狀細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、喉癌是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1-5%，雖在全身惡性腫瘤中占據(jù)的位置不高，但在呼吸道及頭頸部惡性腫瘤中的位置較為重要，在呼吸道惡性腫瘤中僅次于肺癌，占第二位，在頭頸腫瘤中占第2-5位。喉癌多發(fā)生于40歲以上年齡人群，其中世界男女發(fā)病率之比大約為10:1，部分地區(qū)男女發(fā)病率差異略小，如我國(guó)東北地區(qū)男女發(fā)病率差異則小于世界水平。目前流行病學(xué)調(diào)查顯示，吸煙和飲酒是喉癌發(fā)病的高危因素，但具體發(fā)病過(guò)程是個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)變化，同所有

2、的腫瘤一樣，喉癌的發(fā)病和癌基因活化、抑癌基因失活有關(guān)，同時(shí)很多其它因素也可促進(jìn)喉癌的發(fā)生和發(fā)展，如炎癥狀態(tài)、機(jī)體內(nèi)離子通道功能改變等。喉癌的臨床癥狀多表現(xiàn)為聲音嘶啞、呼吸困難甚至吞咽困難等，若合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則表現(xiàn)為頸部包塊。喉癌的病理類(lèi)型大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌。目前喉癌的治療提倡以手術(shù)治療為主，結(jié)合放化療的綜合治療方法，雖然喉癌的治療經(jīng)歷了百余年的進(jìn)展，喉癌發(fā)病及治療的基礎(chǔ)研究也在不停的進(jìn)步，但喉癌患者的五年生存率及術(shù)后生存質(zhì)量并未得到

3、大幅改善。
　　瞬時(shí)受體電位通道超家族（transient receptor potential，TRP）是一種非選擇性鈣離子通道，在鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用。TRP通道目前一般分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)包括 TRPA、TRPC、TRPN、TRPV，第二類(lèi)包括 TRPP和TRPML，他們均具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中均有一內(nèi)嵌的發(fā)卡通道結(jié)構(gòu)，TRP通道分布廣泛，主要通過(guò)介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流作用參與調(diào)節(jié)機(jī)體的機(jī)械感覺(jué)、痛覺(jué)、味覺(jué)、肌肉收縮、細(xì)胞

4、增生、分化、凋亡等眾多生理病理反應(yīng)。但各種TRP通道的作用并不完全相同，部分TRP通道亞類(lèi)可以相互或協(xié)同作用調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。
　　TRPP2通道作為T(mén)RP超家族中的一員，又稱(chēng)之為PKD2(polycystin-2)，目前研究較多和確實(shí)的證據(jù)認(rèn)為T(mén)RPP2的突變與多囊腎的發(fā)病密切相關(guān)。TRPP2在多種組織中廣泛表達(dá)，如血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎上腺和卵巢細(xì)胞。目前研究認(rèn)為T(mén)RPP2的亞細(xì)胞定位有一定的爭(zhēng)議，認(rèn)為可表達(dá)于

5、細(xì)胞質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和原纖毛中，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位最為認(rèn)同。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，TRPP2作為細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放的通道，聯(lián)合三磷酸肌醇受體和雷尼丁受體調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的平衡，參與鈣庫(kù)介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流過(guò)程（(store-operated calcium entry channels, SOCE），從而發(fā)揮各種生理和病理功能，如參與細(xì)胞增殖、凋亡、自吞噬等過(guò)程。
　　腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorɑ，TNF-ɑ）最

6、初是以抗腫瘤因子被發(fā)現(xiàn)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗腫瘤因子，腫瘤壞死因α是一種多向性細(xì)胞因子，其在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)以及抗感染、抗腫瘤方面有重要作用，但研究也表明腫瘤壞死因子α對(duì)腫瘤的作用因條件的不同可產(chǎn)生不同的結(jié)果，雖然是最強(qiáng)的抗腫瘤因子，但在某些情況下也可表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　生物信息學(xué)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于臨床與基礎(chǔ)研究的一門(mén)交叉學(xué)科，它結(jié)合了信息學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)等多種技術(shù)對(duì)大量的生物數(shù)據(jù)從分子水平通過(guò)序列對(duì)比、

7、通路分析、生物聚類(lèi)、統(tǒng)計(jì)分析等進(jìn)行分析、篩選，發(fā)現(xiàn)疾病的異常信息，可作為進(jìn)一步證實(shí)研究的篩選手段，避免盲目無(wú)效性的研究。
　　本研究應(yīng)用人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系，通過(guò)表達(dá)譜測(cè)序、生物信息學(xué)技術(shù)、蛋白印跡、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、鈣成像以及siRNA技術(shù)分兩部分闡述了腫瘤壞死因子α對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜的影響以及腫瘤壞死因子α通過(guò)抑制TRPP2的表達(dá)及其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子釋放來(lái)增強(qiáng)人喉鱗狀細(xì)胞癌He

8、p-2細(xì)胞系的增殖。為進(jìn)一步闡明TRPP2和腫瘤壞死因子α在人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖中的作用以及相關(guān)機(jī)制提供新的依據(jù)，有助于闡明喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并有利于對(duì)喉癌開(kāi)發(fā)新的潛在治療方向，為治療喉癌提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。
　　1.腫瘤壞死因子α對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞mRNA表達(dá)譜的影響及分析
　　既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α對(duì)腫瘤的作用是雙方面的，因?yàn)闂l件的不同可表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制。為探討腫瘤壞死因子α對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌He

9、p-2細(xì)胞的作用，本研究利用mRNA測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)，揭示了TRPP2相關(guān)mRNA在腫瘤壞死因子α處理的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞PKD2基因的mRNA表達(dá)水平顯著下降(和對(duì)照組相比)，由此推測(cè)分析腫瘤壞死因子α可能是通過(guò)下調(diào)TRPP2導(dǎo)致人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的改變。但結(jié)論需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.腫瘤壞死因子α通過(guò)抑制TRPP2的表達(dá)促進(jìn)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　腫瘤壞死因子α和

10、TRPP2都參與機(jī)體細(xì)胞的多種功能，研究表明，鈣離子通道在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，TRPP2作為鈣離子通道中的一員，我們推測(cè)其在喉癌的增殖和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)第一部分的研究我們對(duì)經(jīng)過(guò)腫瘤壞死因子α處理的人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2較對(duì)照組未處理的人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2在mRNA表達(dá)譜的分析中發(fā)現(xiàn)，TRPP2mRNA表達(dá)顯著減少，為進(jìn)一步驗(yàn)證TRPP2是否參與腫瘤壞死因子α對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的影響過(guò)程，我們進(jìn)

11、行了進(jìn)一步的機(jī)制研究。本研究結(jié)果表明腫瘤壞死因子α通過(guò)抑制TRPP2的表達(dá)調(diào)節(jié)PERK-eIF2α信號(hào)通路以及TRPP2介導(dǎo)的鈣離子通道途徑增強(qiáng)了Hep-2細(xì)胞的增殖。主要結(jié)果如下：（1）腫瘤壞死因子α能顯著減少人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的TRPP2的表達(dá)和ATP引發(fā)的鈣離子釋放。（2）siRNA特異敲低TRPP2可顯著抑制ATP引發(fā)的鈣離子釋放、消除腫瘤壞死因子α對(duì)ATP引發(fā)的鈣離子釋放減少的效應(yīng)。（3）人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞

12、經(jīng)過(guò)腫瘤壞死因子α處理或特異敲低TRPP2處理未影響IP3R-I表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度。但腫瘤壞死因子α處理和特異性敲除TRPP2對(duì)抑制TRPP2的表達(dá)有增強(qiáng)效應(yīng)。（4）腫瘤壞死因子α處理增強(qiáng)了人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的增殖及G2/M期的比例，但是減少了G0/G1的比例。而siRNA特異敲低TRPP2后，人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖也增加，其表現(xiàn)為S期和G2/M期比例增加，但G0/G1期細(xì)胞比例減少。（5）腫瘤壞死因子α