中藥蟾酥中蟾蜍甾烯類活性成分的體外代謝研究.pdf

1、背景：蟾酥是由蟾蜍科兩棲爬行動物的耳后腺及皮膚腺分泌物經(jīng)加工而成，是我國著名傳統(tǒng)中藥材。蟾蜍甾烯類化合物是中藥蟾酥中的主要藥效成分，是麝香保心丸、六神丸、六應丸等著名中藥復方的重要活性成分，具有強心、局部麻醉抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性。隨著蟾蜍甾烯類化合物抗腫瘤活性越來越受到重視，針對該類化合物的新藥開發(fā)案例不斷涌現(xiàn)。雖然蟾毒靈等蟾蜍甾烯類化合物對多種人源腫瘤細胞顯現(xiàn)了極強的殺傷能力，該類化合物在活體內的藥效活性并不令人滿意，提示其成

2、藥性上可能存在缺陷。多方面信息證實，蟾蜍甾烯在人及實驗動物中均會被快速代謝清除，嚴重影響其體內藥效發(fā)揮。目前，蟾蜍甾烯類化合物的體內代謝研究時有報道，但絕大多數(shù)代謝研究均是基于實驗動物開展的。然而，考慮到藥物代謝酶等藥物處置蛋白上普遍存在的顯著種屬間差異，這些信息及數(shù)據(jù)的可信程度仍值得商榷。時至今日，蟾蜍甾烯在人體內及不同種屬實驗動物體內的代謝路徑，以及蟾蜍甾烯與其他藥物間的代謝酶介導的潛在相互作用均尚未被很好的研究與揭示。
　　

3、目的：1）明確中藥蟾酥中主要蟾蜍甾烯類化合物在人體內的主要代謝路徑，關鍵代謝酶及動力學行為；從定性和定量兩方面剖析蟾蜍甾烯取代基變異對其代謝酶選擇性及代謝速率的影響。2）尋找蟾蜍甾烯代謝酶選擇性及催化效率的關鍵決定因素，揭示清除的關鍵代謝酶以及結構代謝規(guī)律。3）系統(tǒng)開展蟾蜍甾烯類化合物的代謝種屬間差異研究，從代謝角度分析及比較人與常用實驗動物處置蟾蜍甾烯類化合物的相似性及差異性。4）開展蟾蜍甾烯-人體關鍵代謝酶細胞素色P450相互作用研

4、究，分別明確蟾蜍甾烯代表性化合物蟾毒靈對細胞素色 P450的抑制情況以及潛在共服藥物對細胞素色 P450介導的蟾毒靈代謝的影響效果。為蟾蜍甾烯類新藥的研發(fā)以及含該類成分的中藥復方在臨床的安全合理使用提供研究基礎和理論依據(jù)。
　　方法：1）首先借助體外代謝研究手段，利用人源肝組織勻漿，以代表性蟾蜍甾烯為研究對象，開展的I相及II相代謝路徑研究。經(jīng)由代謝輪廓分析、代謝產物制備等研究手段對該類化合物的代謝物譜進行確證；經(jīng)由特異性抑制劑抑

5、制分析、相關性分析等對該類化合物的主要代謝酶進行歸屬；經(jīng)由代謝動力學分析、清除半衰期等研究對該類化合物的代謝穩(wěn)定性進行表征。2）此外，借助分子對接計算化學手段，揭示負責催化蟾蜍甾烯代謝的關鍵氨基酸及影響代謝過程的核心結構域。3）借助體外代謝抑制研究手段，分別開展蟾毒靈對細胞色素P450的抑制選擇性、抑制能力（IC50）、抑制動力學及參數(shù)（Ki、KI、Kinact）、抑制機制研究，以及蟾毒靈共服藥物對細胞色素P450介導的蟾毒靈代謝的抑制

6、能力研究（IC50）。結果：
　　一、蟾蜍甾烯體外代謝屬性研究
　　1）I相代謝研究：在前期對華蟾毒精I相代謝的基礎上，分別對蟾毒靈、脂蟾毒配基、蟾毒它靈、日蟾毒它靈和沙蟾毒精的I相代謝路徑開展了系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在人肝微粒體中，上述蟾蜍甾烯均選擇性被細胞色素P4503As（包括CYP3A4和CYP3A5）催化代謝，主要分別生成1-羥基和5-羥基產物。然而，蟾蜍甾烯化合物間在代謝穩(wěn)定性，以及與 CYP3A4、CYP3A5

7、的催化選擇性、動力學參數(shù)上存在顯著差異。
　　2）蟾蜍甾烯結構-細胞色素P4503As（CYP3As）關系研究：研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍甾烯與 CYP3As的親和力參數(shù) Km分別與該類化合物在人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性以及與CYP3A5在I相代謝路徑中的貢獻具有一定的相關性。針對人肝微粒體中的動力學參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，人肝微粒體中 Km值小的蟾蜍甾烯清除率則偏高，代謝穩(wěn)定性較差。而針對人重組單酶CYP3A中Km分析發(fā)現(xiàn)，多種取代基的引入可不同程度的

8、改變蟾蜍甾烯與 CYP3A4和 CYP3A5的親和力，影響 CYP3A4和CYP3A5在蟾蜍甾烯代謝中的貢獻率。蟾蜍甾烯-I相代謝關系如下：11位羥基、12位酮基可增強與CYP3A5的親和力，提升CYP3A5的催化選擇性；16位乙?；?9位醛基在降低與 CYP3A4的親和力同時增強與 CYP3A5的親和力，提升CYP3A5的催化選擇性。
　　3）II相代謝研究：分別對華蟾毒精、蟾毒靈、脂蟾毒配基、遠華蟾毒精、去乙?；A蟾毒精、蟾

9、毒它靈的II相代謝路徑開展了系統(tǒng)的研究。在人肝S9中，上述蟾蜍甾烯會選擇性被磺酸轉移酶2A1催化代謝，生成產物3-O-磺酸鹽。不同蟾蜍甾烯的3位磺酸結合反應符合底物抑制動力學，但動力學參數(shù)Km、Ksi和Vmax等均變化顯著。
　　4）蟾蜍甾烯結構-磺酸轉移酶2A1（SULT2A1）關系研究：研究結果揭示，蟾蜍甾烯3位羥基構型是決定該類化合物能否發(fā)生磺酸結合反應的關鍵，SULT2A1催化活性空腔中 His99是負責識別蟾蜍甾烯類化合

10、物的關鍵氨基酸殘基。而蟾蜍甾烯在SULT2A1活性空腔中的構象與朝向，及其與His99間的能否形成相互作用等均是影響磺酸結合反應能否發(fā)生的關鍵因素。研究蟾蜍甾烯-II相代謝關系如下：親水取代基（如 C11、C14、C16位羥基）會顯著削弱蟾蜍甾烯與SULT2A1的親和力，而C5位羥基作為例外則會顯著增強與SULT2A1的親和力；C19位醛基會阻礙磺酸結合反應；C16位乙?；鶗档团cSULT2A1的親和力。
　　二、蟾蜍甾烯體外代謝

11、種屬差異研究
　　1）I相代謝種屬差異研究：在多種動物肝微粒體中，蟾蜍甾烯類化合物蟾毒靈和脂蟾毒配基的代謝輪廓與人肝微粒體中較為相似。CYP3A亞家族是催化該反應的主要代謝酶。然而，不同種屬間微粒體催化蟾毒靈和脂蟾毒配基代謝的動力學行為和動力學參數(shù)上顯著差異。小型豬和小鼠肝微粒體催化蟾毒靈發(fā)生5位羥化反應的動力學行為及相關參數(shù)與人肝微粒體觀察到的相關信息更為相近，而猴肝微粒體介導的脂蟾毒配基的5位羥化反應在動力學行為上與脂蟾毒配基

12、在人肝微粒體中的代謝行為更為相近。猴肝微粒體催化5位單羥化產物生成的效率顯著高于人肝微粒體和其他動物肝微粒體，小鼠肝微粒體中蟾毒靈和脂蟾毒配基5位羥化反應的清除率與人肝微粒體中對應的數(shù)值更為相近。
　　2）II相代謝種屬差異研究：在多種動物肝微粒體中，小鼠和狗S9缺少磺酸結合代謝路徑，而在大鼠、兔、豚鼠、小型豬、猴 S9中，蟾毒靈和脂蟾毒配基的代謝路徑與人肝S9中一致。不同動物種屬中SULT2A1是催化該反應的主要代謝酶。兔肝S9

13、催化二者磺酸結合產物生成效率高，磺酸結合產物在肝S9間的體外代謝內在清除率順序為兔或人>小型豬>豚鼠>猴>大鼠。
　　三、蟾毒靈對細胞色素P4503As的抑制作用研究
　　1）蟾毒靈（BF）和其3位氧化代謝產物3-酮-蟾毒靈（KBF）是細胞色素P4503As（CYP3As）的強選擇性抑制劑，IC50值分別是10.4和0.22μM。抑制動力學研究提示BF和KBF對CYP3As的抑制均符合混合抑制模型，Ki分別為1.90和0.2

14、0μM。
　　2）BF對CYP3A4的抑制作用存在基于時間的抑制情況，這種現(xiàn)象產生的原因與CYP3A4介導的KBF生成有關系，提示BF對CYP3A4的抑制作用屬于自殺式抑制。不僅如此，KBF與人肝微粒體催化孵育30分鐘后可進一步提高對CYP3A4的抑制作用，IC50值由0.37降低至0.036μM。BF和KBF對CYP3A4的失活呈現(xiàn)時間-和濃度-依賴的特性，并符合一級動力學過程。在人肝微粒體中，BF失活CYP3As的KI和Kin

15、act分別為21.1μM和0.141 min-1；KBF失活CYP3As的KI和Kinact分別為0.66μM和0.064 min-1。在人CYP3A4重組單酶中，BF失活CYP3A4的KI和Kinact分別為1.13μM和0.097 min-1；KBF失活CYP3A4的KI和Kinact分別為0.25μM和0.161 min-1。
　　3）通過清洗試驗和保護劑保護實驗對KBF介導的CYP3A4基于時間抑制作用的機制進行初步揭示。

16、研究提示KBF可能通過代謝生成的高活性代謝產物而誘發(fā)對CYP3A4的不可逆抑制作用。抑制過程可能導致CYP3A4功能快速喪失而引發(fā)嚴重的藥物藥物相互作用，亦或導致蟾毒靈以及其結構類似物代謝受阻而誘發(fā)急慢性心臟毒、肝毒性以及其他難以預料的嚴重毒性反應。
　　結論：
　　1）細胞色素P450介導的羥化反應和磺酸轉移酶介導的磺酸結合反應分別被鑒定為蟾蜍甾烯系列化合物在人體中代謝清除的I相和II相代謝路徑。蟾蜍甾烯的5位和1位碳是該

17、類化合物的主要羥化位點，催化這一代謝反應的代謝酶被歸屬為細胞色素P4503As。此外，蟾蜍甾烯的3位羥基是該類化合物的主要磺酸結合位點，催化這一代謝反應的代謝酶被歸屬為磺酸轉移酶2A1。而蟾蜍甾烯3位羥基構型是決定該類化合物能否發(fā)生磺酸結合反應的關鍵。
　　2）蟾蜍甾烯類化合物結構母核上的取代基可顯著影響自身與代謝酶的相互作用，因此，這類化合物在人體內的代謝行為和動力學參數(shù)千差萬別。研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍甾烯結構母核上不同位點的取代基可顯

18、著影響蟾蜍甾烯與代謝酶CYP3As和SULT2A1的結合作用，集中體現(xiàn)于表觀動力學參數(shù)Km值。蟾蜍甾烯-I相代謝關系研究提示，11位羥基、12位酮基可增強與 CYP3A5的親和力，提升 CYP3A5的催化選擇性；16位乙酰基、19位醛基在降低與 CYP3A4的親和力同時增強與CYP3A5的親和力，提升CYP3A5的催化選擇性。研究蟾蜍甾烯-II相代謝關系時發(fā)現(xiàn)：親水取代基（如C11、C14、C16位羥基）會顯著削弱蟾蜍甾烯與SULT2A

19、1的親和力，而C5位羥基作為例外則會顯著增強與SULT2A1的親和力；C19位醛基會阻礙磺酸結合反應；C16位乙酰基會降低與SULT2A1的親和力。
　　3）多種實驗動物肝制備物中蟾蜍甾烯類化合物蟾毒靈和脂蟾毒配基的I相和II相代謝輪廓與人肝制備物中二者的代謝輪廓較為相似，但小鼠和狗肝S9缺少磺酸結合代謝路徑。CYP3As和SULT2A1被分別鑒定為不同種屬動物肝臟中介導蟾毒靈和脂蟾毒配基發(fā)生I相和II相代謝的主要代謝酶。然而，不

20、同種屬間肝臟制備物對蟾毒靈和脂蟾毒配基的催化效率間存在顯著差異。
　　4）蟾毒靈和其3位氧化代謝產物3-酮-蟾毒靈是CYP3A4的強選擇性抑制劑。我們首次發(fā)現(xiàn)3-酮-蟾毒靈可能通過代謝生成的高活性代謝產物而誘發(fā)對CYP3A4的不可逆抑制作用。而正是在此過程中，CYP3A4由于介導蟾毒靈的代謝而引起了自身催化功能的喪失，屬于自殺式抑制作用。因此，蟾毒靈及其代謝產物對CYP3A4的抑制作用不僅會影響蟾毒靈及其結構類似物的代謝，還可能通