糖腎合劑對糖尿病腎病大鼠模型足細胞相關(guān)分子nephrin和podocin保護作用機制研究.pdf

1、背景和目的:糖尿病腎病是臨床上糖尿病最常見的并發(fā)癥，具有進展快、治療難度大的特點，且近年來患病率逐步攀升。蛋白尿是糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)，從早期微量白蛋白尿到中晚期大量蛋白尿，目前已經(jīng)證實蛋白尿是影響糖尿病腎病進展的獨立危險因素，因此探求蛋白尿的發(fā)病機制及尋找降低蛋白尿保護腎功能的方法顯得尤為迫切。
　　以往研究者對糖尿病腎病病理的研究主要集中在腎小球肥大、基底膜增厚、系膜區(qū)細胞增生及基質(zhì)增多、小球硬化等方面，然而這些病理改變僅

2、能解釋部分臨床表現(xiàn)，更多的病因仍不明確，近些年，人們將研究方向轉(zhuǎn)向了腎小球足細胞上面，因為足細胞是腎臟濾過屏障的最后一層，不僅與機械屏障相關(guān)更涉及到電荷屏障，所以一時成為熱點[1]。足細胞在維持腎小球濾過及阻止蛋白尿漏出方面起著至關(guān)重要的作用[2-3]。任何形式的損傷無論是自身免疫反應(yīng)還是藥物毒性作用均可導(dǎo)致足細胞受損，進而影響其功能。足細胞損傷主要表現(xiàn)為細胞肥大、足突消失、數(shù)量減少甚至脫落凋亡。相鄰足突之間有著類似于拉鏈狀結(jié)構(gòu)的一層隔

3、膜，隔膜是由多種分子相互結(jié)合而成的復(fù)合體，裂孔隔膜是濾過膜的最后一層，如果其完整性遭到破壞將會導(dǎo)致蛋白尿的漏出，體內(nèi)高血糖、AGEs、氧化應(yīng)激作用均會引起足細胞的損傷裂孔隔膜受損。有實驗表明在糖腎鼠模型中初期足細胞的數(shù)量就有所減少，隔膜上的分子Nephrin、Podocin蛋白含量也會下降，到后期這種變化更加明顯。足細胞損傷與腎小球硬化亦有關(guān)系[4]。Donblier等[5]在糖腎患者病理中觀察到在早期Nephrin的表達就可出現(xiàn)異常，

4、并且與蛋白尿的發(fā)生和腎小球濾過有明顯相關(guān)性，因此研究足細胞損傷與糖尿病腎病的關(guān)系，為臨床上防治糖尿病腎病提供新的依據(jù)。
　　吾師姚源璋教授從事臨床診療工作近四十年，擅長腎臟病的防治尤其對糖尿病腎病有其獨特見解。在結(jié)合多年臨床經(jīng)驗及糖尿病腎病發(fā)病特點的基礎(chǔ)上創(chuàng)制出了糖腎合劑，該方切合糖腎病機，兼顧標本虛實，本以氣陰兩虛為主，標實以血瘀、痰濕、濁毒為甚，所以該方具有益氣生津、通絡(luò)活血之功，在臨床上取得了滿意療效。前期實驗中我們證實了該

5、方具有調(diào)節(jié)JAK/STAT通路[6]、調(diào)節(jié)腎組織SOCS-1、TGF-β1及VEGF[7]的表達來保護腎臟的作用。糖腎合劑方降低蛋白尿的作用機制是否跟調(diào)節(jié)足細胞分子nephrin和podocin的表達有關(guān)呢？該實驗通過動物模型的方式將分為模型組、治療組、對照組合正常組，最后通過測定各組腎組織中nephrin和podocin的含量，來分析糖腎合劑方對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，及其可能機制。
　　研究方法:糖尿病大鼠模型的建立:給予S

6、D大鼠高糖高脂飼料5周后腹腔注射小劑量鏈尿佐菌素(35mg/kg);成模標準:大鼠非空腹血糖＞16.7mmol/L。
　　1.分組:將大鼠分為正常組，成模后再分為模型組、對照組及糖腎合劑高、低組共5組。
　　2.給藥方法:按照15ml/Kg/d的劑量以灌胃的方式分別給予各組相應(yīng)的藥液。給藥干預(yù)共8周。
　　3.療效評價方法:給藥8周期后，在處死大鼠前以尾部采血的方式測定每只大鼠血糖、稱重、收集并測定大鼠24小時尿蛋白定

7、量;麻醉大鼠后用一次性采血針腹主動脈采血并檢測相關(guān)生化指標（血肌酐、血清白蛋白、尿素氮）;對大鼠腎組織做病理切片并HE染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)病變;采用免疫印跡(Western blotting)法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測糖尿病大鼠腎組織中nephrin、podocin蛋白的表達和nephrinmRNA、podocinmRNA的含量并應(yīng)用圖像分析軟件(Image-Pro Plus)進行半定量分析，SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行分析處理，P

8、＜0.05為有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:1.24h尿蛋白定量:模型組蛋白定量明顯高于正常組，糖腎高、低組及氯沙坦對照組蛋白定量低于模型組且有統(tǒng)計學意義;
　　2.腎功能:模型組肌酐、尿素氮水平明顯高于正常組，糖腎高、低組及氯沙坦對照組肌酐、尿素氮水平低于模型組且有統(tǒng)計學意義;
　　3.血清白蛋白:模型組血清蛋白明顯低于正常組，糖腎高、低組及氯沙坦對照組血清蛋白高于模型組且有統(tǒng)計學意義;

9、r>　　4.模型組腎組織中nephrin、podocin蛋白含量與正常組相比明顯減少(p＜0.01)，糖腎高、低劑量組及藥物對照組與模型組相比腎組織中nephrin、podocin表達含量增加(p＜0.01)，與正常組比較nephrin、podocin表達含量減少(p＜0.01)。
　　5.病理變化:光鏡下可見正常組腎小球形態(tài)規(guī)整清晰可見，無明顯細胞增生，系膜區(qū)無明顯增寬，毛細血管襻無壓迫，無球囊粘連，小管間質(zhì)未見纖維化。模型組光