自噬在豬胰腺干細胞增殖及向胰島β樣細胞分化中的作用及機理.pdf

1、糖尿病是目前世界上對公眾健康危害最嚴重的一類慢性疾病，主要由胰島素分泌不足或機體不能有效利用胰島素引起，臨床表現(xiàn)為高血糖，可引發(fā)心臟病、腎功能衰竭、中風(fēng)、下肢截肢、神經(jīng)損傷及視力損傷等嚴重并發(fā)癥。糖尿病的核心問題在于胰島β細胞的缺損。豬胰腺干細胞(porcine pancreatic stem cells，pPSCs)是由胎豬胰腺組織中分離出來的成體干細胞，該細胞可以定向誘導(dǎo)分化為胰島β樣細胞。因為豬的胰島素結(jié)構(gòu)與人相近，所以經(jīng)pPSC

2、s誘導(dǎo)分化得到的胰島β樣細胞有望用于臨床糖尿病的治療。
　　自噬是真核生物中一種進化上高度保守的細胞機制，是用于降解、回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程，對維持細胞及組織器官的穩(wěn)態(tài)有非常重要的作用。有研究表明，自噬在維持胰腺中胰島β細胞的數(shù)量、功能及維持血糖平衡中發(fā)揮重要作用。干細胞自我更新和分化的過程需要對細胞內(nèi)蛋白和細胞器數(shù)量進行嚴格控制，自噬能快速有效地降解細胞內(nèi)酶和轉(zhuǎn)錄因子等物質(zhì)，因此，自噬在干細胞自我更新和分化中

3、也發(fā)揮重要作用。但是到目前為止，自噬對胰腺干細胞的影響仍不清楚。
　　本實驗探究了自噬在pPSCs增殖及向胰島β樣細胞分化中的作用及機理。實驗一方面用穩(wěn)定表達EGFP-LC3B的豬胰腺干細胞系(pPSCs-EGFP-LC3B)實時監(jiān)測細胞內(nèi)自噬的變化，最終證明饑餓誘導(dǎo)的自噬可以促進pPSCs的增殖。另一方面，發(fā)現(xiàn)自噬水平在pPSCs向胰島β樣細胞誘導(dǎo)分化后期升高，抑制自噬會影響pPSCs的誘導(dǎo)分化效率。本實驗為進一步揭示pPSCs

4、增殖及分化機理奠定了理論基礎(chǔ)。
　　1.自噬能促進pPSCs增殖
　　首先，通過激光共聚焦觀察和Western blotting實驗，我們對pPSCs-EGFP-LC3B的自噬水平進行了評估，發(fā)現(xiàn)血清饑餓4h可以誘導(dǎo)該細胞發(fā)生自噬，添加氯喹可以抑制自噬的發(fā)生。接著，BrdU染色、流式細胞術(shù)檢測細胞周期及Western blotting實驗的結(jié)果表明，與正常培養(yǎng)的pPSCs相比，無血清誘導(dǎo)的自噬組內(nèi)pPSCs的BrdU陽性率高

5、，處于S期的細胞比例高，細胞內(nèi)PCNA的蛋白表達水平較高，說明細胞增殖速度加快，加入氯喹抑制自噬后，這些指標都降低，細胞增殖速度減慢。同時，我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓誘導(dǎo)自噬發(fā)生的同時，活性β-catenin表達量增高、入核明顯，經(jīng)典Wnt信號通路被激活，于是我們推測自噬對pPSCs的促增殖作用可能受經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控。
　　2.自噬是pPSCs誘導(dǎo)分化為胰島β樣細胞的必要條件
　　首先，我們用實驗室已經(jīng)建立的誘導(dǎo)分化體系對pPS

6、Cs進行誘導(dǎo)，并成功得到了DTZ染色陽性，在mRNA水平高表達胰島素、Glut2、NKX6.1、MafA，表達胰島素和C肽蛋白并且能對高糖應(yīng)答分泌胰島素的胰島β樣細胞。其后，通過對處于誘導(dǎo)分化第0、1、3、4、6、9天的細胞樣進行Western blotting檢測，我們發(fā)現(xiàn)從誘導(dǎo)的第4天開始細胞內(nèi)自噬一直維持在較高水平。第4天是由貼壁誘導(dǎo)換為懸浮誘導(dǎo)的時間點，在第4天添加氯喹抑制自噬，細胞不能聚團得到胰島樣細胞團，在第5天添加氯喹抑制