幾種DNA結(jié)合蛋白檢測技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用.pdf

1、DNA與蛋白質(zhì)序列特異性識別和相互作用在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與DNA結(jié)合蛋白的異常相關(guān)。DNA結(jié)合蛋白的研究已越來越受到人們的關(guān)注，成為后基因組時代的重要研究領(lǐng)域。相應(yīng)的檢測技術(shù)蓬勃發(fā)展，從早期針對單個位點的低通量檢測技術(shù)到近幾年隨著高通量技術(shù)平臺如高密度芯片和新一代測序技術(shù)發(fā)展起來的針對全基因組的高通量檢測方法，每種技術(shù)都能從不同側(cè)面揭示了DNA與蛋白質(zhì)相互作用的機理，從而使人們對DNA與蛋白質(zhì)相互作用

2、的機理認(rèn)識越來越深入。本論文以DNA與蛋白質(zhì)相互作用為研究主題開展了一系列的研究工作，概括如下：發(fā)展了一種高靈敏度檢測DNA結(jié)合蛋白的新方法；運用雙鏈DNA芯片技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)錄因子AP1(c-Jun)TRE(5'-TGAGTCA-3’)序列單堿基突變后各個序列與蛋白質(zhì)的親和力變化；優(yōu)化了染色質(zhì)免疫沉淀實驗條件，使之適合本實驗室研究平臺；運用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)結(jié)合新一代SOLiD測序平臺分析了轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在K562細胞中的全基因組結(jié)合

3、位點，具體如下：
　　 1．基于限制性內(nèi)切酶-滾環(huán)擴增的高靈敏度轉(zhuǎn)錄因子檢測方法
　　 細胞內(nèi)含量較低的轉(zhuǎn)錄因子可能在基因調(diào)控中起重要作用，靈敏地檢測到這些低豐度轉(zhuǎn)錄因子蛋白的存在具有重要研究意義。本研究針對轉(zhuǎn)錄因子具有DNA序列特異結(jié)合的特點，利用DNA限制性內(nèi)切酶切位點序列及滾環(huán)擴增能夠放大信號的特點，發(fā)展了一種高靈敏度檢測轉(zhuǎn)錄因子的新方法，該方法具有較高的靈敏度，并且具有高通量，多目標(biāo)分析的潛能，同時避免了常規(guī)蛋白

4、檢測需要抗體的缺點，將蛋白信號檢測轉(zhuǎn)化為核酸信號檢測，操作更加簡便。
　　 2．運用雙鏈DNA芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子AP1(c-Jun)與特異DNA序列的結(jié)合
　　 轉(zhuǎn)錄因子與DNA靶位點的結(jié)合和對許多基因表達的調(diào)節(jié)失控可以導(dǎo)致多種生理疾病，然而，不同的蛋白質(zhì)與不同的DNA位點的結(jié)合機制仍然不很清楚，因此選擇一種高通量的方法同時研究蛋白質(zhì)與多種不同的DNA位點的結(jié)合效率是非常有意義的。
　　 雙鏈DNA芯片已經(jīng)被證

5、明為一種高通量研究DNA/蛋白質(zhì)相互作用的有效工具，因此我們選擇運用雙鏈DNA芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子AP1(c-Jun)與特異DNA序列的結(jié)合。C-Jun蛋白是AP1家族中最活躍的一員，其功能與細胞的增值，死亡和分化等相關(guān)，異常表達可導(dǎo)致腫瘤、動脈粥樣硬化和糖尿病等疾病。將經(jīng)典保守的AP1識別的TRE序列(5’-TGAGTCA-3’)進行單堿基突變，研究c-Jun二聚體與不同序列之間的結(jié)合親和力，發(fā)現(xiàn)任何一個堿基突變都會導(dǎo)致DNA與蛋白質(zhì)

6、之間結(jié)合親和力的下降，但不同位置堿基之間及同一位置不同突變之間的親和力下降幅度不同，結(jié)合已有的X-ray晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，說明不同位點堿基在蛋白質(zhì)與DNA相互作用過程中所起的作用是不同的。我們的實驗數(shù)據(jù)對于理解蛋白質(zhì)與不同的DNA位點的結(jié)合機制具有理論意義。
　　 3．染色質(zhì)免疫沉淀實驗條件優(yōu)化
　　 染色質(zhì)免疫沉淀實驗是檢測體內(nèi)生理狀態(tài)下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的最有效方法，其特點是時間長，步驟多，影響因素也多。關(guān)于染色質(zhì)免

7、疫沉淀實驗程序有很多版本，基本流程相似，但具體實驗參數(shù)卻各不相同，原因在于每個研究所采用的細胞系、所研究的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的抗體及免疫沉淀時用的一抗載體都不相同，超聲儀器也各不相同，所以無法照搬哪個現(xiàn)成的實驗程序，必須重新摸索適合于自己實驗室條件及研究對象的方法。本研究在經(jīng)典染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)基礎(chǔ)上根據(jù)本實驗所用儀器和研究對象進行了以下幾個方面的條件優(yōu)化：用凝膠遷移率分析實驗檢測所用抗體特異性與親和力；檢測c-Jun靶基因在k562細胞中

8、表達狀況，以排除基因表達細胞特異性的影響；基于國產(chǎn)細胞粉碎儀進行超聲條件優(yōu)化，以獲得適當(dāng)大小可以用于后續(xù)測序的片段。綜合這些關(guān)鍵因素，確立了適合我們研究條件的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)參數(shù)。
　　 4．運用ChIP-seq方法研究轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在K562細胞中的全基因組結(jié)合位點
　　 自2007 Johnson和Robertson分別在Science和Nature Methods發(fā)表利用ChIP-Seq研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點文

9、章以來，已有多個轉(zhuǎn)錄因子ChIP-Seq研究報道。然而，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的結(jié)合位點并沒有人類全基因組水平的系統(tǒng)研究。
　　 我們用新一代SOLiD測序平臺分析了轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在K562細胞中的染色質(zhì)免疫沉淀片段，揭示了其在K562細胞中全基因組結(jié)合位點，共獲得283個結(jié)合位點。在結(jié)合位點序列中進行共有基序分析，發(fā)現(xiàn)共有基序比例為28．6％，說明c-Jun體內(nèi)結(jié)合序列變異性較高；用生物信息學(xué)分析結(jié)合位點的臨近基因(neigh