北五味子多糖的分離、純化及其抗氧化作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　五味子是一種傳統(tǒng)中藥，來(lái)源于木蘭科的植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱為“北五味子”，而木蘭科華中五味子Schisandrasphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)則稱為“南五味子”。五味子中含有不少的多糖成分，多糖又稱為碳水化合物，其通用的分子式為(CH2O)n。五味子多糖大多具有抗氧化、抗衰老的作用，在體內(nèi)可以保護(hù)人的腎臟、

2、肝臟。目前已有文獻(xiàn)中對(duì)五味子多糖抗氧化和衰老方面的研究并不深入，尤其是對(duì)其作用機(jī)制的研究更是少之又少，因此探究五味子多糖產(chǎn)生的抗氧化作用及其作用機(jī)制具有不小的意義。NF-E2(Nuclearfactor erythriod2-related factor2，Nrf2)目前已經(jīng)被證明是與抗氧化作用最密切相關(guān)的靶標(biāo)之一，當(dāng)體內(nèi)、外受到氧化應(yīng)激等相關(guān)刺激后，Nrf2在細(xì)胞漿中與Keap1迅速地解離開來(lái)并被活化，接著Nrf2從核外向核內(nèi)運(yùn)動(dòng)。本

3、實(shí)驗(yàn)以人胚腎細(xì)胞293T為模型，研究北五味子多糖對(duì)293T細(xì)胞的抗氧化、增殖作用的影響以及作用機(jī)制，為氧化應(yīng)激、衰老的預(yù)防和治療提供新的思路和方向，也為北五味子多糖開發(fā)出相關(guān)的食品、藥品提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞的培養(yǎng)
　　按照常規(guī)方法培養(yǎng)293T細(xì)胞株，培養(yǎng)液按如下比例配制:DMEM高糖培養(yǎng)基∶FBS∶青鏈霉素混合液=(45ml∶5ml∶500ul)，于恒溫37℃，恒量含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)每天觀察

4、細(xì)胞生長(zhǎng)情況，傳代培養(yǎng)。
　　2.北五味子粗多糖(SCP)的提取、分離、純化
　　到藥店購(gòu)買北五味子的藥材，經(jīng)過(guò)石油醚脫脂后得到水提粗多糖，經(jīng)過(guò)脫色、脫蛋白及過(guò)DEAE-52、sephadexG-100層析柱進(jìn)行分離、純化得到一個(gè)純化的多糖組分，收集液凍干成粉末后在冷凍干燥的條件下保存。
　　3.北五味子多糖的抗氧化作用
　　根據(jù)SOD、CAT、MDA、GSH含量或活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書操作
　　4.北五味

5、子多糖對(duì)Nrf2及其下游因子的調(diào)節(jié)作用
　　采用Western blot檢測(cè)不同濃度的純化后多糖組分作用于293T細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游的NQO1、HO-1的蛋白表達(dá)水平變化，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)不同濃度的多糖組分給藥后對(duì)ARE-luc熒光素酶的影響。
　　5.北五味子多糖對(duì)細(xì)胞核內(nèi)外Nrf2活性及其穩(wěn)定性的影響
　　采用Western blot檢測(cè)不同濃度的多糖組分給藥后293T細(xì)胞Nrf2在核內(nèi)外蛋白表達(dá)水平的變

6、化。用Western blot檢測(cè)多糖組分預(yù)處理細(xì)胞2h后給或不給蛋白合成抑制劑CHX對(duì)不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白水平表達(dá)的影響。
　　6.北五味子多糖對(duì)Nrf2與DNA結(jié)合的活性的影響
　　多糖組分處理293T細(xì)胞后收集并裂解細(xì)胞，提起核蛋白，用EMSA法檢測(cè)Nrf2與DNA結(jié)合活性的變化。
　　7.北五味子多糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　以293T細(xì)胞為研究對(duì)象，10umol·L-1的叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)作

7、為激動(dòng)劑用于陽(yáng)性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)各組用不同濃度多糖組分作用于細(xì)胞，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.水提得到的粗多糖經(jīng)過(guò)脫色、脫蛋白后總多糖含量為40％。以水為洗脫劑，依次經(jīng)過(guò)DEAE-52層析柱分離純化得到多糖組分SCP-1、過(guò)sephadexG-100層析柱分離純化后得到純化組分SCP-2，總多糖含量為86％。
　　2.SCP-2能上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化因子NQO1、H

8、O-1蛋白水平的表達(dá)，增強(qiáng)ARE熒光素酶的活性。
　　3.SCP-2能增強(qiáng)293T細(xì)胞中GSH、CAT的含量，減少M(fèi)DA的含量，增加293T細(xì)胞中SOD的活力。
　　4.SCP-2能降低核外的Keap1、Nrf2蛋白水平的表達(dá)，使Nrf2活化并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)SCP-2還可以增加Nrf2的蛋白穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期。
　　5.SCP-2能增強(qiáng)Nrf2的DNA結(jié)合活性。
　　6.SCP-2可以促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖，

9、抑制癌細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　北五味子多糖(S CP)能通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化因子比如二相代謝酶NQO1、H0-1的表達(dá)，增加GSH、CAT等內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá)，還能減少細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，增強(qiáng)SOD的活力，對(duì)正常細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，對(duì)癌細(xì)胞則是抑制其增殖。這些作用產(chǎn)生的機(jī)制與北五味子多糖能誘導(dǎo)Nrf2從核外向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)Nrf2的蛋白穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期，并能增強(qiáng)Nrf2的