miR-99a-5p和miR-639在骨髓增生異常綜合征患者骨髓中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的：探究miR-99a-5p和miR-639在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平情況，并且分析其與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，同時利用miRNA靶基因在線預(yù)測軟件等生物信息學(xué)方法對兩者的靶基因進(jìn)行預(yù)測及功能分析，探討miR-99a-5p和miR-639在MDS疾病過程中的意義，以期為MDS發(fā)病機(jī)制研究及臨床診療工作中提供新的理論依據(jù)。
　　方法：首先應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)合分層聚類的方法分別對9例MDS患者（

2、5例IPSS低、中危和4例IPSS高?；颊撸┖?例健康對照組骨髓細(xì)胞中miR-99a-5p和miR-639的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。然后利用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time PCR）技術(shù)在52例初診MDS患者（包括31例IPSS低危和中危1在內(nèi)的相對低危組患者、21例IPSS中危2和高危在內(nèi)的相對高危組患者）、18例初診MDS轉(zhuǎn)急性髓系白血?。ㄒ韵潞喎Q“轉(zhuǎn)白”）患者及19例健康對照組的骨髓細(xì)胞中miR-99a-5p和miR-639的表

3、達(dá)水平進(jìn)行驗證，并分析兩者在MDS不同亞組的表達(dá)情況，然后分別探索兩者與包括染色體核型分析、外周血血象（中性粒細(xì)胞絕對值、血紅蛋白量及血小板計數(shù)）和骨髓原始細(xì)胞比例在內(nèi)的臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，運(yùn)用Miranda、Targetscan和Microcosm三種靶基因在線分析軟件分別預(yù)測miR-99a-5p和miR-639可能的靶基因，取其預(yù)測結(jié)果的交集，通過進(jìn)行基因功能富集分析(GO-analysis)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG Pa

4、thwayanalysis)，并進(jìn)一步結(jié)合現(xiàn)有相關(guān)的靶基因文獻(xiàn)報道選出最終可能的潛在靶基因。
　　結(jié)果：1.miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)合分層聚類結(jié)果顯示在MDS患者中有92個miRNA表達(dá)顯著上調(diào)（比值R≥2）和198個miRNA表達(dá)顯著下調(diào)（比值R≤0.5）。其中，miR-99a-5p呈現(xiàn)表達(dá)水平的上調(diào)(R=4.42，p＜0.05)，miR-639表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)(R=0.18，p＜0.01)。2.利用Real-time PCR技術(shù)

5、在大樣本MDS患者及MDS轉(zhuǎn)白患者骨髓細(xì)胞中分別對miR-99a-5p和miR-639表達(dá)水平進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示:與健康對照組相比，miR-99a-5p在總MDS樣本骨髓中呈顯著高表達(dá)（R=4.69，p=5.05×10-13），與基因芯片的結(jié)果一致，其中相對低危組（低危組和中危1組）的表達(dá)量是對照組的2.40倍(p=9.61×10-4)，相對高危組（中危2組和高危組）的表達(dá)量是對照組的6.66倍(p=2.65×10-8)，MDS轉(zhuǎn)白組的

6、表達(dá)量是對照組的6.35倍(p=5.66×10-6)。miR-639在總MDS樣本骨髓中的表達(dá)水平相較健康對照組則呈現(xiàn)顯著下調(diào)（R=0.64，p=7.90×10-5），與基因芯片結(jié)果一致，其中相對低危組（低危組和中危1組）的表達(dá)量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.46），相對高危組（中危2組和高危組）的表達(dá)量是對照組的0.42倍（p=1.06×10-7），MDS轉(zhuǎn)白組的表達(dá)量是對照組的0.41倍(p=1.29×10-7)。
　

7、　3.將miR-99a-5p和miR-639在所有MDS患者（包括MDS轉(zhuǎn)白患者）中的表達(dá)量分別與MDS患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示:患者染色體核型分析情況與miR-99a-5p表達(dá)量無明顯差異(異常組:2.89±1.31正常組:2.00±1.93，p=0.12)，外周血血象與其表達(dá)量之間無明顯相關(guān)（中性粒細(xì)胞絕對值:r=-0.252，p=0.094;血紅蛋白量:r=0.016，p=0.913;血小板計數(shù):r=0.241，p=

8、0.107），但骨髓原始細(xì)胞比例與其表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.645，p=1.33×10-6）。而miR-639的表達(dá)量與MDS患者染色體核型分析情況呈現(xiàn)相關(guān)性（C=0.378，p=0.010），并且miR-639在染色體異常組的表達(dá)量相較染色體正常組低（異常組:0.54±0.29正常組:0.79±0.31，p=0.015），外周血血象與其表達(dá)量之間同樣無明顯相關(guān)（中性粒細(xì)胞絕對值:r=0.033，p=0.829;血紅蛋白量:r=-0.0

9、36p=0.809;血小板計數(shù):r=-0.148，p=0.326），骨髓原始細(xì)胞比例與其表達(dá)量則呈負(fù)相關(guān)（r=-0.527，p=1.42×10-4）。
　　4.運(yùn)用Miranda、Targetscan和Microcosm三種靶基因在線分析軟件分別對miR-99a-5p和miR-639的靶基因進(jìn)行預(yù)測并取其結(jié)果的交集顯示:miR-99a-5p可能的靶基因12個，而miR-639可能的靶基因4個。miR-99a-5p和miR-639可

10、能靶基因基因功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果顯示:miR-99a-5p的靶基因功能主要富集于有機(jī)環(huán)化合物、DNA、核酸等的結(jié)合和蛋白磷酸酶、轉(zhuǎn)移酶等的激活及RNA生物合成過程、轉(zhuǎn)錄過程等的調(diào)控(p＜0.05)，信號通路主要富集于白細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腫瘤蛋白聚糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等(p＜0.05)。miR-639的靶基因功能富集于有機(jī)環(huán)化合物、特定序列DNA、核酸等的結(jié)合和特定序列DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性及RNA代謝過程、轉(zhuǎn)錄過

11、程等的調(diào)控(p＜0.05)，尚未得到有關(guān)靶基因的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)合miRNA負(fù)調(diào)控原理及現(xiàn)有關(guān)于miR-99a-5p和miR-639預(yù)測的靶基因的相關(guān)文獻(xiàn)報道得出:miR-99a-5p最終可能潛在的靶基因為ST5，miR-639最終可能潛在的靶基因為POU2F2。
　　結(jié)論：1.miR-99a-5p的表達(dá)水平與MDS骨髓原始細(xì)胞比例呈正相關(guān)，高表達(dá)的miR-99a-5p可能參與了MDS疾病的發(fā)生發(fā)展過程。
　　2.與正常

12、對照組相比，miR-639在MDS相對低危組（低危組和中危1組）患者骨髓細(xì)胞的表達(dá)量無明顯差異，而在相對高危組（中危2組和高危組）及轉(zhuǎn)白組患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)顯著降低;在所有MDS患者（包括MDS轉(zhuǎn)白患者）中，miR-639的表達(dá)水平與骨髓原始細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，并且染色體異常組的患者骨髓細(xì)胞中miR-639的表達(dá)量相對染色體正常組更低。以上提示低表達(dá)的miR-639可能參與了MDS疾病的進(jìn)展。
　　3.miR-99a-5p可能通過靶