Nrp1介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞再分布加重皮下荷瘤小鼠的缺血性腦損傷.pdf

1、缺血性腦卒中已躍居全世界人口疾病負(fù)擔(dān)的前三位，腫瘤也早已成為威脅人類死亡的重要原因。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤患者極易并發(fā)腦卒中，且3個(gè)月內(nèi)達(dá)到發(fā)病高峰。由此可見腫瘤并發(fā)腦卒中患者在臨床上日益多見，其主要原因有以下三個(gè):1）腫瘤患者因凝血紊亂、放化療和手術(shù)治療的副反應(yīng)等原因?qū)е氯毖阅X卒中的發(fā)生;2）腫瘤治療手段和觀念的進(jìn)步，尤其目前腫瘤的治療策略中提倡患者帶瘤生存，導(dǎo)致腫瘤患者的生存期延長，因此腫瘤患者并發(fā)缺血性腦卒中的機(jī)率顯著升高。3）腫瘤和缺血

2、性腦卒中的發(fā)病高峰年齡相同，均高發(fā)于60-80歲之間，這為腫瘤患者并發(fā)缺血性腦卒中提供了先決條件。
　　以往臨床研究多關(guān)注于腫瘤患者發(fā)生缺血性腦卒中原因和機(jī)率，然而腫瘤患者發(fā)生的缺血性腦損傷與單純?nèi)毖阅X卒中的損傷相比有何不同，其機(jī)制如何？目前尚無系統(tǒng)性的研究，僅少數(shù)回顧性病例分析發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的腦卒中死亡率高、預(yù)后較差。本課題主要研究預(yù)存腫瘤對缺血性腦卒中的加重作用。鑒于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞對腦卒中發(fā)揮保護(hù)作用卻介導(dǎo)了腫瘤

3、的免疫逃逸，我們側(cè)重于探討Treg細(xì)胞在腫瘤加重缺血性腦損傷中的作用，以期為腫瘤患者缺血性腦卒中的治療提供新的思路。
　　本課題的主要研究方法為:1）回顧性的臨床病例分析，即將缺血性腦卒中患者按是否存在腫瘤分為腫瘤合并缺血性腦卒中患者組和單純?nèi)毖阅X卒中患者組，分析其腦梗體積、NIHSS評分、洼田飲水試驗(yàn)評分、院內(nèi)死亡等指標(biāo)在兩組之間的差別。2)采用皮下荷瘤復(fù)合遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈電凝的方法建立腫瘤合并缺血性腦卒中的模型，觀察其梗死體積

4、和遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)、感覺功能的缺損是否加重。3）用野生型C57小鼠和T、B淋巴細(xì)胞缺陷的Rag1-/-小鼠（需進(jìn)行免疫重建）建立腫瘤合并缺血性腦卒中的模型后檢測外周血、腦組織和腫瘤中Treg細(xì)胞比例的變化，以證明腫瘤小鼠缺血性腦卒中后發(fā)生了Treg細(xì)胞再分布。4）用CD25中和抗體將內(nèi)源性Treg細(xì)胞消融，觀察腫瘤對缺血性腦卒中損傷加重的作用是否被逆轉(zhuǎn)，證明Treg細(xì)胞再分布在腫瘤加重缺血性腦損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。5）Rag14-/-小鼠建立腫

5、瘤合并缺血性腦卒中的模型后采用Treg細(xì)胞(分別用神經(jīng)氈毛1(Nrp1)中和抗體和對照抗體孵育）和CD4+CD25-T細(xì)胞回輸重建免疫系統(tǒng)，觀察Nrp1中和抗體能否阻斷Treg細(xì)胞再分布和逆轉(zhuǎn)腫瘤對缺血性腦卒中損傷的加重作用。6）采用Nrp1中和抗體腹腔注射的方法對腫瘤小鼠合并的缺血性腦卒中進(jìn)行治療，進(jìn)一步驗(yàn)證我們理論的正確性。取腦組織行mRNA測序。
　　本研究的主要結(jié)果有:1）腫瘤合并缺血性腦卒中患者的MRI腦片梗死體積顯著大

6、于單純?nèi)毖阅X卒中患者，且NIHSS評分也明顯高于配對患者。腫瘤并發(fā)缺血性腦卒中患者的院內(nèi)死亡率和感染率也明顯高于配對患者。這說明腫瘤患者的缺血性腦損傷較單純?nèi)毖阅X卒中更重。2）腫瘤合并缺血性腦卒中小鼠的腦片梗死體積和21天內(nèi)的感覺運(yùn)動(dòng)功能的缺損較單純?nèi)毖阅X卒中小鼠顯著增大（變差），進(jìn)一步驗(yàn)證了腫瘤對缺血性腦損傷的加重作用。3）野生型C57小鼠在腫瘤合并缺血性腦卒中建模后，外周血Treg細(xì)胞明顯下調(diào)，腦組織浸潤的Treg細(xì)胞也顯著下

7、調(diào)，而腫瘤組織中募集的Treg細(xì)胞上調(diào)。在Rag1-/-小鼠上建模后免疫重建（將Treg細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞回輸?shù)酵庵苎?，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。此實(shí)驗(yàn)證明腫瘤小鼠發(fā)生缺血性腦卒中后Treg細(xì)胞發(fā)生了從外周血進(jìn)一步向腫瘤中遷移的再分布過程。4)內(nèi)源性Treg細(xì)胞消融后腫瘤對缺血性腦卒中損傷加重作用消失。這說明Treg細(xì)胞再分布在腫瘤加重缺血性腦損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。5）Rag1-/-小鼠建模后行免疫重建（阻斷Treg細(xì)胞上的Nr

8、p1受體），發(fā)現(xiàn)Nrp1受體阻斷后，腫瘤對缺血性腦卒中的損傷加重作用被逆轉(zhuǎn)，同時(shí)，Treg細(xì)胞的再分布也消失。這說明Nrp1介導(dǎo)了Treg細(xì)胞再分布，且在腫瘤加重缺血性腦損傷中發(fā)揮了決定性的作用。6）Nrp1中和抗體腹腔注射后，腫瘤合并缺血性腦卒中腦片的梗死體積明顯減輕，錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)步次數(shù)也顯著改善，Treg細(xì)胞的再分布也被逆轉(zhuǎn)（即腫瘤中Treg細(xì)胞比例顯著降低，而外周血顯著升高）。mRNA測序結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤小鼠發(fā)生缺血性腦卒中后腦內(nèi)

9、炎癥相關(guān)的基因明顯升高，而Nrp1抗體注射后下調(diào)腦內(nèi)炎癥相關(guān)的基因。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明預(yù)存腫瘤缺血心腦卒中的損傷較單純?nèi)毖阅X損傷加重。主要的機(jī)制為:缺血性腦卒中發(fā)生后使Treg細(xì)胞發(fā)生了由外周血進(jìn)一步向腫瘤中遷移的再分布，使外周血和腦組織中Treg細(xì)胞比例下降，從而減弱了Treg細(xì)胞對腦卒中的保護(hù)作用。同時(shí)，我們還證明Treg細(xì)胞的再分布主要由Nrp1受體介導(dǎo)，因此阻斷Treg細(xì)胞上的Nrp1受體可阻斷Treg細(xì)胞的