胃癌細(xì)胞通過提高有氧糖酵解增強(qiáng)耐藥性的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　在我國，胃癌位列所有腫瘤發(fā)病率和死亡率的第二位，嚴(yán)重危害我國國民健康。化療是腫瘤的重要治療手段之一。順鉑是胃癌化療的一線用藥，但因能引起多藥耐藥而制約臨床療效。以往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)瓦伯格效應(yīng)增強(qiáng)順鉑耐藥，但也有報(bào)導(dǎo)耐藥細(xì)胞糖酵解水平降低。故闡明胃癌順鉑耐藥細(xì)胞糖酵解特征以及與耐藥性的關(guān)系能為逆轉(zhuǎn)耐藥提供治療思路。
　　目的:
　　研究胃癌順鉑天然耐藥和獲得性耐藥細(xì)胞的糖酵解特征，闡明糖酵解對耐藥性的影響

2、和作用機(jī)制，研究耐藥細(xì)胞通過何種機(jī)制調(diào)控糖酵解。
　　方法:
　　前期通過濃度梯度誘導(dǎo)法建立胃癌獲得性耐藥細(xì)胞BGC823/DDP株，選取MGC803細(xì)胞株作為天然耐藥模型，BGC823細(xì)胞株作為藥敏感細(xì)胞。運(yùn)用比色法檢測敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞糖酵解相關(guān)的底物和產(chǎn)物，包括葡萄糖消耗量、丙酮酸和乳酸產(chǎn)量。通過MTS法、流式凋亡和Western Blot檢測敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞對糖剝奪和糖酵解抑制劑2-DG的敏感性以及兩種處理與耐藥性

3、的影響。用二維電泳-質(zhì)譜法得到敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的蛋白差異表達(dá)譜，并通過蛋白功能聚類分析篩選出與糖酵解相關(guān)的差異蛋白。用siRNA敲除該蛋白，比色法檢測耐藥細(xì)胞葡萄糖消耗量、丙酮酸、乳酸和ATP產(chǎn)量。用MTS法、流式凋亡和Western Blot檢測敲除差異蛋白后對耐藥細(xì)胞順鉑敏感性的影響。將敏感細(xì)胞過表達(dá)差異蛋白，用MTS和Western Blot檢測順鉑敏感性。用RT-qPCR、Western Blot及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等手段研究

4、耐藥細(xì)胞對差異表達(dá)蛋白的調(diào)控機(jī)制。免疫組化法分析糖酵解相關(guān)的差異蛋白在鄰近的非腫瘤胃粘膜組織和胃癌組織表達(dá)的差異性，及與病人臨床特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　天然耐藥細(xì)胞MGC803和后天獲得性耐藥細(xì)胞BGC823/DDP比敏感細(xì)胞BGC823糖酵解水平增強(qiáng)，其葡萄糖消耗量更大，丙酮酸和乳酸的產(chǎn)量更高。耐藥細(xì)胞對糖剝奪或糖酵解抑制劑2-DG更敏感。抑制糖酵解能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的耐藥性。二維電泳-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)糖酵解過程中的烯醇化酶

5、ENO1(Enolase1)在BGC823/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，Western Blot驗(yàn)證結(jié)果一致。敲除ENO1后耐藥細(xì)胞葡萄糖消耗下降，且丙酮酸、乳酸和ATP產(chǎn)量下降，細(xì)胞耐藥性降低。敏感細(xì)胞BGC823過表達(dá)ENO1能提升糖酵解水平，抵抗順鉑引起的凋亡。RT-qPCR結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞中ENO1 mRNA水平較敏感細(xì)胞輕度下調(diào)，說明并非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。放線菌酮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的ENO1蛋白半衰期沒有明顯差異。提示ENO1可能

6、受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。應(yīng)用micRNA靶點(diǎn)預(yù)測得到ENO1可能是miR-22的靶點(diǎn)，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-22在耐藥細(xì)胞中呈低表達(dá)。Western Blot檢測提示當(dāng)在耐藥細(xì)胞過表達(dá)miR-22模擬物或在敏感細(xì)胞使用miR-22抑制劑，則能下調(diào)或上調(diào)ENO1的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示miR-22可結(jié)合ENO1的3'-UTR區(qū)，抑制ENO1 mRNA的功能。耐藥細(xì)胞過表達(dá)miR-22模擬物或敏感細(xì)胞使用miR-22抑制劑，能相應(yīng)下調(diào)或