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文檔簡介
1、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell,PSC)的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性對于遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞和機體的正常生命活動至關(guān)重要。多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。胚胎干細(xì)胞在無限增殖過程中能保持遺傳物質(zhì)高度穩(wěn)定性。迄今為止,對維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)機制研究主要集中在體細(xì)胞上,而我們對胚胎干細(xì)胞維持遺傳
2、物質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)機制研究并不全面,因此深入開展胚胎干細(xì)胞在遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性維持方面的相關(guān)研究有助于我們認(rèn)識并了解胚胎干細(xì)胞的特性,為胚胎發(fā)育、胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。Filia,又名Khdc3(KH domain containing 3),特異性表達于小鼠生長中的卵母細(xì)胞、囊胚以及胚胎干細(xì)胞中,是ESC維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵多功能蛋白分子。Filia可通過兩個方面的作用來維持小鼠胚胎干細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。一、Filia
3、能與多能干細(xì)胞特異性蛋白Floped相互結(jié)合,促進停滯復(fù)制叉的重啟,減少由復(fù)制壓力所引起的細(xì)胞內(nèi)源性損傷。二、Filia參與調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR),從而維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。實驗室前期工作基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ilia S151位點以及Filia S349位點對Filia的功能發(fā)揮至關(guān)重要。Filia第349位絲氨酸殘基與蛋白的入核相關(guān),在損傷誘導(dǎo)情況下,F(xiàn)ilia S349能被相關(guān)激
4、酶磷酸化修飾,磷酸化的Filia能順利轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核中,參與DNA損傷修復(fù)過程。Filia第151位絲氨酸殘基的磷酸化修飾參與復(fù)制叉重啟的過程,當(dāng)復(fù)制叉受阻時,F(xiàn)ilia-Floped聚集到受阻的復(fù)制叉上,在蛋白激酶ATR的調(diào)控下,F(xiàn)ilia的第151位絲氨酸發(fā)生磷酸化,重啟復(fù)制叉。FILIA蛋白除了能被磷酸化修飾外,還能被泛素化修飾。前期FILIA的P-MS(免疫共沉淀-質(zhì)譜)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Filia有四個泛素化位點,但我們還不清楚這四個泛素
5、化位點是否參與調(diào)控細(xì)胞的損傷修復(fù)功能,調(diào)控方式是否獨立。在本論文中,我們探究了Filia泛素化修飾在Filia蛋白調(diào)控胚胎干細(xì)胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性及DNA損傷反應(yīng)的相關(guān)功能。
為探究泛素化修飾是否和怎樣調(diào)控Filia在胚胎干細(xì)胞中的功能,本論文用分子克隆構(gòu)建出9個Filia泛素化位點突變的慢病毒表達載體,利用慢病毒包裝與感染等手段,得到9個Filia泛素化位點突變的小鼠胚胎干細(xì)胞系。功能研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ilia第141位賴氨酸的泛素化
6、是Filia蛋白調(diào)控DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵,該泛素化位點突變后,小鼠胚胎干細(xì)胞系維持較高的內(nèi)源性DNA損傷。并且FiliaK141突變后影響Filia DNA損傷修復(fù)的能力。深入探究Filia第141位賴氨酸的泛素化對損傷修復(fù)的影響機制,我們發(fā)現(xiàn)Filia K141的突變后并不影響Filia與PARP1(細(xì)胞質(zhì)中與DDR調(diào)控相關(guān)的重要蛋白修飾酶)的結(jié)合,但Filia K141突變后,F(xiàn)ilia S349不能被磷酸化,且Filia不能轉(zhuǎn)運到
7、細(xì)胞核中。綜上,F(xiàn)ilia泛素化修飾對Filia調(diào)控胚胎干細(xì)胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性十分重要。當(dāng)胚胎干細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂時,F(xiàn)ilia能定位到斷裂處,調(diào)控同源重組修復(fù)雙鏈斷裂。FiliaK141泛素化位點突變后,使Filia S349位點不能被磷酸化修飾,進而FILIA蛋白的入核受影響,F(xiàn)ILIA不能定位到受損的DNA位點,修復(fù)損傷位點。
盡管我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Filia K141位點十分重要,但是現(xiàn)有的證據(jù)并不能揭示Filia泛素化修
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