PPARδ在角質形成細胞及銀屑病中的作用及其分子機制研究.pdf

1、銀屑病是一種自發(fā)性的自身免疫性疾病，影響著約全球約2％的人口，在中國發(fā)病率稍低，但中國人口基數(shù)龐大，有著約500-800萬的銀屑病患者。由于銀屑病目前還不能根治，且特別容易復發(fā)，給患者身心及家庭帶來了嚴重的損害。咪喹莫特(imiquimod，IMQ)最初用于治療人皮膚癌和外生殖器/肛周疣等疾病，后被研究者開發(fā)并用在小鼠皮膚上來誘導銀屑病樣的癥狀。由于該模型能很好的誘導出人銀屑病的絕大部分癥狀，且模型簡單易制備，迅速成為研究銀屑病的一個重

2、要模型。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于Ⅱ型核受體超家族，可分為3種亞型(PPARα/γ/δ)。PPARδ在代謝綜合征、動脈粥樣硬化、脂代謝紊亂等疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。前期的實驗發(fā)現(xiàn)PPARδ在人銀屑病皮損和IMQ誘導的小鼠銀屑病皮膚中高表達，提示其可能在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。目前銀屑病的治療沒有很好的辦法，且不能徹底的

3、治愈，本實驗借助IMQ誘導的銀屑病樣小鼠以及人角質原代細胞進行一系列實驗，為PPARδ在銀屑病中的作用提供更為有力和直接的證據(jù)，以期為銀屑病的治療提供新的治療靶點。
　　第一部分 PPARδ在銀屑病皮損中的表達情況
　　目的:為了考察PPARδ在人和小鼠銀屑病皮損及正常皮膚中的表達情況，從而為PPARδ在銀屑病中的作用提供依據(jù)。
　　方法:取健康人皮膚和銀屑病人皮損處皮膚，小鼠正常皮膚和IMQ刺激后的皮膚，進行免疫組織

4、化學(immunohistochemistry，IHC)、實時熒光定量PCR(quantitativepolymerase chain reaction，Q-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)實驗，考察PPARδ在正常皮膚和銀屑病皮損中、表皮和真皮層中的表達差異。并進一步探討了PPARδ在銀屑病皮損部位的特異性表達。
　　結果:人銀屑病皮損和小鼠經IMQ刺激皮膚中的PPARδ表達較健康皮膚和正常小鼠皮膚均升高

5、。通過IHC染色觀察到，人皮損處的PPARδ主要表達于表皮上基底層。真皮、表皮的表達偏好來看，人及小鼠皮膚中PPARδ主要表達于表皮層，而真皮層中含量很少。PPARδ于健康人皮膚中表達很少，同時也很少表達于其它幾種皮膚疾病的皮損中，表明了PPARδ在銀屑病皮損部位表達的相對特異性。
　　結論:PPARδ在人銀屑病皮損處及IMQ誘導的小鼠銀屑病皮損中有所升高，表明了PPARδ很可能在銀屑病的發(fā)病中起到了很重要的作用。
　　第二

6、部分 PPARδ對于原代角質細胞體外分泌細胞因子的作用
　　目的:考察PPARδ在不同細胞炎癥模型中所起的作用及其潛在機制。本部分我們一共借助了三類比較常規(guī)的與銀屑病關系比較密切的細胞模型。(1)白介素(interleukin，IL)-17、IL-22和腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor，TNF-α)等細胞因子在銀屑病的發(fā)展中起到重要的作用，我們探尋了PPARδ對于在這些細胞因子作用下角質細胞炎癥反

7、應的影響。(2)12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-O-Yetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)在體內也常用于誘導小鼠的銀屑病樣模型，且有報道稱TPA能有到小鼠皮膚中PPARδ表達的上調，在體外實驗中TPA常被用于誘導原代角質細胞的分化，我們預在本實驗中考察PPARδ是否也對TPA作用的原代角質起到一定的調控作用。(3) IMQ乳膏溶液作用于角質細胞是最近被研究者開發(fā)并使用的一個銀屑病細胞模型，能夠

8、更進一步的反應銀屑病角質細胞的病理情況，我們預考察PPARδ在該體外細胞模型中所起到的作用。
　　方法:本實驗成功提取了人原代角質細胞，并分別成功構建了三種角質細胞炎癥模型。利用Q-PCR、WB等方法考察了PPARδ選擇性激動劑GW0742和專一性拮抗劑GSK3787在這些模型中對炎癥的影響，并進一步考察了PPARδ在這一過程中的作用機制。
　　結果:(1)通過實驗在眾多的PPARδ響應基因中確定了改變最大的一個基因:脂質分

9、化相關蛋白（Adipose differentiation-related protein，ADRP），并以它作為后續(xù)實驗中考察PPARδ是否激活的一個指標;(2)PPARδ激動劑GW0742能加劇IL-17A、IL-22或TNF-α誘導的原代角質細胞炎癥情況;(3) TPA誘導的原代角質細胞炎癥情況不依賴于PPARδ通路，但我們發(fā)現(xiàn)TPA+GW0742能共同激活人黑素瘤缺乏因子2(Absent in Melanoma2，AIM-2)的

10、表達，而最近有報道稱AIM-2在銀屑病的發(fā)展中占有一定的作用。(4) PPARδ抑制劑能緩解IMQ誘導的原代角質細胞炎癥情況;
　　結論:本部分實驗在細胞模型上驗證了PPARδ在銀屑病相關炎癥方面的作用，首先PPARδ的拮抗劑能降低IL-17、IL-22或TNF-α誘導的炎癥因子的分泌。TPA誘導的原代角質細胞炎癥雖然不依賴于PPARδ，但是當TPA和PPARδ的激動劑同時存在時，AIM-2的表達被上調，這說明PPARδ還能在一定

11、的程度上激活一些通路來協(xié)同其它的刺激因素產生其原來所沒有的作用，PPARδ的這一現(xiàn)象也與之前報道的其能調控豐富的下游基因的功能相一致。此外，IMQ誘導的原代角質細胞炎癥能夠被PPARδ的激動劑加強，同時能被PPARδ的抑制劑減弱。
　　第三部分 PPARδ在體內銀屑病樣小鼠模型中的作用及其機制研究
　　目的:前面實驗表明PPARδ對于IMQ誘導的原代細胞炎癥起到了一定的作用，且PPARδ在銀屑病皮損處高表達，為了考察PPAR

12、δ在體內銀屑病小鼠模型中的作用及其作用機制，設計這一部分實驗。
　　方法:首先配制PPARδ的體內注射溶液，在IMQ刺激前2h、刺激后4h、8h注射入小鼠皮下，空白組用PBS代替注射。連續(xù)6天后，處死小鼠取材，皮膚均分為4份，一份檢測Q-PCR，一份檢測WB，一份檢測IHC，一份用作流式細胞術檢測使用。通過H&E染色、IHC染色、Q-PCR、流式細胞術(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)等技術，我們觀察了小鼠皮膚的病理情況并檢

13、測了小鼠皮膚中銀屑病相關炎癥因子及炎癥細胞的變化情況。對于PPARδ作用機制的研究，我們將不同組的小鼠皮膚提取蛋白，進行WB實驗，篩選信號通路。
　　結果:PPARδ專一性拮抗劑GSK3787能下調IMQ引起的表皮棘層肥厚現(xiàn)象，同時從H&E的結果上看，真皮層的浸潤細胞也有所降低。GSK3787還能降低IMQ引起的IL-17a、IL-23、IL-22和IL-1b等的表達升高，并且GSK3787的這些作用呈濃度和時間依賴性。此外，TC

14、Rβ+IL-17A+及TCRγδ+ IL-17A+(T17+)細胞在IMQ+GSK組也較IMQ組有所下調。對于PPARδ在IMQ模型中作用機制的研究，我們發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT及STAT3信號通路在模型組小鼠皮損中表達上調，我們進一步注射該通路蛋白的抑制劑，發(fā)現(xiàn)PPARδ的作用被減弱。
　　結論:PPARδ拮抗劑能夠緩解IMQ引起的銀屑病樣皮損癥狀，且能降低銀屑病相關炎癥因子及炎癥細胞的表達，提示其可能作為一種潛在的銀屑病治療新靶點

15、。IMQ誘導的銀屑病樣小鼠皮膚炎癥中，PPARδ是通過PI3K-AKT及STAT3通路來發(fā)揮作用的。
　　第四部分阻斷Alox8能減輕IMQ在小鼠皮膚上引起的銀屑病樣反應
　　目的:之前的實驗中已經較為深入地探明了PPARδ在銀屑病發(fā)病中的作用，但是PPARδ的內源性配體還不是很明確。雖然我們在第一部分中闡明，Alox8/8s-HETE是PPARδ潛在的上游配體中表達最高的一對，且有相關研究表明，Alox8/8s-HETE可

16、能在皮膚炎癥性疾病的發(fā)生中起到一定的作用。但是它們是否真的在體內對PPARδ有這調控的作用我們還不能肯定，為了進一步考察PPARδ的上游配體Alox8對于PPARδ的潛在調控作用，進行了以下實驗。
　　方法:目前由于沒有市售的PPARδ中和性抗體，為了方便Alox8體內的阻斷，我們構建了慢病毒包裝的Alox8 shRNA干擾序列。我們首先考察了用Alox8 shRNA干擾后，利用Q-PCR實驗方法測量了PPARδ各響應基因的激活情

17、況并用免疫共沉淀的方法考察了PPARδ與RXRa結合情況的變化。隨后，我們又進一步利用Q-PCR法、WB法和FCM的方法考察了Alox8 shRNA干擾后，小鼠皮膚中總體炎癥情況的改變以及銀屑病相關炎癥蛋白表達的變化以及炎癥細胞數(shù)量的改變。
　　結果:體內Alox8 shRNA干擾后，Alox8蛋白的表達量較陰性對照序列有所下降，此外，小鼠皮膚內PPARδ各響應基因的表達均下調，其中以ADRP的表達下降的最多，與體外實驗的趨勢相近