生物鐘紊亂及吸煙致動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一組稱為動(dòng)脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，可波及全身動(dòng)脈血管，以大、中動(dòng)脈最常見。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見的類型，已經(jīng)成為全世界致死率位居第一的疾病，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過惡性腫瘤對(duì)人類的威脅。因此如何有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，預(yù)防冠心病的發(fā)生，已成為亟待解決的問題。目前通過Framingham研究及大型流行病學(xué)調(diào)查，已明確了其諸多冠心病危險(xiǎn)因素，比如吸煙

2、、肥胖、高血壓、高血脂、年齡、糖尿病、靜息生活方式，以及高尿酸血癥、高同型半胱氨酸血癥等。目前，生物鐘紊亂對(duì)冠心病的影響越來越受重視。研究表明，生物鐘周期異?？赡苤苯佑绊懶穆省⒀獕?、激素水平、自主神經(jīng)功能以及血液成分，導(dǎo)致多種心血管疾病，降低心臟功能，對(duì)健康產(chǎn)生重大危害。代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)是一組以肥胖、高血糖、血脂異常以及高血壓等聚集發(fā)病的臨床癥候群，是多種心血管疾病(cardiovascular

3、disease，CVD)的危險(xiǎn)因素在同一個(gè)體聚集的病理狀態(tài)。我國的研究結(jié)果顯示，代謝綜合征患者10年心血管病危險(xiǎn)性較非代謝綜合征增加了1.85倍。正常的生物鐘節(jié)律對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)有重要的臨床意義，而慢性的生物節(jié)律紊亂，比如倒班工作，與胰島素抵抗、肥胖、代謝綜合征和糖尿病等的高患病率密切相關(guān)。Bmal1(brain and muscle Arnt-like protein)基因，又稱為MOP3或ARNT3，是其中的一種生物鐘子鐘基因，是維

4、持生物鐘節(jié)律性振蕩的關(guān)鍵基因。源于染色體免疫共沉淀測序分析，在小鼠肝臟中，時(shí)間解析的全基因組Bmal1結(jié)合圖顯示碳?xì)浠衔锎x是這一生物鐘的主要輸出。骨骼肌是胰島素依賴的血糖處理的主要部位，但肌肉生物鐘在調(diào)節(jié)糖攝入及代謝方面特殊的作用還無從知道。本研究即是通過小鼠骨骼肌特異性敲除Bmal1研究其對(duì)肌肉本身及整體血糖及脂肪代謝的影響，從而在代謝方面探討生物鐘紊亂引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。
　　研究表明，吸煙是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子。

5、據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吸煙20min即可損傷冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮，而冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期主要發(fā)生在冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞。但吸煙對(duì)血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)動(dòng)脈粥樣化形成的病灶，顯示了細(xì)胞粘附分子比如ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的增長。確切的證據(jù)表明在對(duì)于各種刺激的炎癥反應(yīng)中p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(p38MAPK)擔(dān)負(fù)著一個(gè)關(guān)鍵的角色。然而p38MAPK信號(hào)通路在粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)方面的影響還沒

6、有被探討。本研究即是通過觀察尼古丁對(duì)小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確吸煙對(duì)冠心病的致病機(jī)理，并探討p38MAPK在細(xì)胞粘附分子表達(dá)中的作用。
　　研究表明，吸煙可以影響HRV及皮質(zhì)醇的分泌節(jié)律，這說明吸煙與生物鐘節(jié)律有關(guān)，可以通過影響生物鐘節(jié)律導(dǎo)致體內(nèi)的一系列變化。吸煙亦與代謝綜合征有密切關(guān)系。現(xiàn)有資料證明，p38MAPK參與了生物鐘基因的表達(dá)及晝夜節(jié)律的輸入和輸出。
　　由此可見，生物鐘

7、紊亂、吸煙和代謝綜合征緊密相關(guān)，三者可能相互影響起到協(xié)同作用。而p38MAPK可能是其中的關(guān)鍵信號(hào)通路。因此，本研究在分別觀察生物鐘紊亂及吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的致病機(jī)制的同時(shí)，進(jìn)一步探討兩者之間的相互影響及內(nèi)在聯(lián)系，從而闡明其致病原因。
　　第一部分骨骼肌內(nèi)在生物鐘Bma11缺乏對(duì)肌肉本身代謝的影響
　　目的:觀察骨骼肌選擇性敲除Bmal1對(duì)肌肉糖脂代謝的影響及相關(guān)基因及酶的改變，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。
　　方法:骨骼肌

8、選擇性敲除Bmal1小鼠為觀察對(duì)象，Bmal1-/-小鼠(B6.129-Arntltm1Bra/J)由Jackson實(shí)驗(yàn)室提供，為實(shí)驗(yàn)組，記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl)，控制組為WT組(MCK-Cre-/BMfl/fl)。KO組及WT組根據(jù)進(jìn)食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組)，禁食后飼喂組（Refed組）。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12∶12光照黑暗循環(huán)，光照開始時(shí)間于7:00a.m.，記為ZT0。8-12周

9、齡的小鼠被用來研究。分離生長10周的WT組和KO組小鼠的后肢肌肉TA、Soleus和GN，肝臟，下丘腦，用qRT-PCR、免疫印跡法、組織免疫熒光法觀察比較以下基因及蛋白的表達(dá):1、生物鐘基因Bmal1、Rev-erbα;2、糖脂代謝相關(guān)基因MCAD、CPT-1b、LPL、FAS、Glut4、PDK4。分別從WT組和KO組生長4周的小鼠的后肢肌肉分離原代成肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用細(xì)胞免疫熒光染色及qRT-PCR觀察比較兩組間細(xì)胞分化情況及肌生

10、成相關(guān)基因Mck、Myf5、Myogenin、MLC1、Myh3的表達(dá)。用核磁共振成像技術(shù)評(píng)估10周時(shí)兩組間肌肉的質(zhì)量。分離生長10周的WT組和KO組后肢肌肉TA、EDL，測定TA、EDL的脂肪酸氧化率和葡萄糖氧化率。分離生長10周的WT組和KO組后肢肌肉TA，行免疫組織化學(xué)熒光染色及免疫印跡，比較MyHC IIA和MyHC IIB的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:KO組原代成肌細(xì)胞的分化、各成肌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)未受影響，總肌肉占體重百分

11、比及單個(gè)肌肉占體重百分比未受影響。在正常小鼠中，禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下Glut4蛋白、Bmal1蛋白在比目魚肌及肝臟中表達(dá)明顯增加;在禁食狀態(tài)下，Rev-erbα蛋白和PDK4蛋白在脛前肌及比目魚肌表達(dá)增加。在禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下，KO組PDK4蛋白表達(dá)水平在TA和Soleus中均顯著增加，Glut4蛋白表達(dá)水平在TA和Soleus中均顯著減少;而在禁食狀態(tài)下，PDK4和Glut4的蛋白表達(dá)水平兩組間未見明顯差異。qRT-PCR分析PDK4、MC

12、AD、CPT-1b也表現(xiàn)出了同樣的趨勢(P＜0.05)。KO組骨骼肌的葡萄糖氧化水平減低，而脂肪酸β-氧化水平增加(P＜0.05)。應(yīng)用qRT-PCR分析了兩組在9AM(ZT2)和5PM(ZT10)時(shí)有關(guān)葡萄糖和脂肪酸代謝基因的在TA中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與脂肪代謝有關(guān)的基因MCAD與CPT-1b在9AM時(shí)KO組表達(dá)明顯增加，而PDK4在9AM及5PM時(shí)均明顯增加。應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，KO組脛前肌(TA)中的肌纖維MyH

13、C IIA增加，而MyHC IIB減少。
　　第二部分骨骼肌內(nèi)在生物鐘Bmal1缺乏對(duì)全身代謝的影響
　　目的:觀察骨骼肌選擇性敲除Bmal1對(duì)機(jī)體整體糖脂代謝的影響，并進(jìn)一步探討肥胖形成的機(jī)制。
　　方法:骨骼肌選擇性敲除Bmal1小鼠為觀察對(duì)象，Bmal1-/-小鼠(B6.129-Arntltm1Bra/J)由Jackson實(shí)驗(yàn)室提供，為實(shí)驗(yàn)組，記為KO組(MCK-Cre+/BMfl/fl)，控制組為WT組(MCK

14、-Cre-/BMfl/fl)。KO組及WT組根據(jù)進(jìn)食狀態(tài)不同又分為禁食組(Fasting組)，禁食后飼喂組（Refed組）。根據(jù)飲食類型KO組及WT組又分為普食飼養(yǎng)組(Chow)及高脂飼養(yǎng)組(HFD)。每組小鼠5-6只。均給予持續(xù)的12∶12光照黑暗循環(huán)，光照開始時(shí)間于7:00a.m.，記為ZT0。8-12周齡的小鼠被用來研究。取WT組及KO組眼球后靜脈血，比較兩組在Refed和Fasting狀態(tài)下血清游離脂肪酸(FFA)、甘油(Gly

15、cerol)、甘油三酯(Triglyceride)血糖(Glucose)、膽固醇(Cholestorel)水平。分離小鼠肝臟，包括Refed和Fasting組、Chow組和HFD組，行肝臟甘油三酯提取測定含量及油紅O染色，比較在不同條件下WT組和KO組肝臟脂肪含量。比較WT組和KO組在Chow和HFD情況下體重的變化，觀察4-12周。比較WT組和KO組在禁食0、12、24、36小時(shí)時(shí)體內(nèi)脂肪含量的變化。用ComprehensiveLab

16、 Animal Monitoring System(CLAMS)測定兩組的呼吸交換率、氧消耗量、總體活動(dòng)水平。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示在禁食狀態(tài)下(Fasted)，KO組循環(huán)中的游離脂肪酸(FFA)、甘油(Glycerol)和甘油三酯(Triglyceride)水平均明顯降低，分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01;而血糖水平顯著升高，P＜0.01。在禁食后飼喂?fàn)顟B(tài)下(Refed，4hrs)，兩組間以上指標(biāo)無明顯差異。KO組肝

17、臟中的甘油三酯(Triglyceride)含量在禁食狀態(tài)下明顯減少，P＜0.01。肝臟切片的油紅O染色(oil-red-O staining)圖像顯示，在禁食狀態(tài)下，WT組肝臟脂肪滴明顯增多，而KO組肝臟脂肪滴明顯較少。無論是普食飼喂組還是高脂飼喂組，在9AM時(shí)KO組肝臟中甘油三酯(TG)含量均明顯減少(P＜0.01)，肝臟切片的油紅O染色也顯示出了同樣的趨勢。在高脂飼喂組，KO組在12周時(shí)體重明顯減低，P＜0.01;體脂含量在4周和1

18、2周時(shí)均表現(xiàn)出了明顯減低，分別為P＜0.05，P＜0.01。發(fā)現(xiàn)在禁食12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)時(shí)KO組體脂的含量均明顯少于WT組，分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05。兩組間呼吸交換率、每天的食物攝入量、每小時(shí)的氧消耗量、總體活動(dòng)水平無明顯差異。
　　第三部分尼古丁經(jīng)由p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)ICAM-I和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)
　　目的:探討吸煙對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性標(biāo)志物ICAM-1和VC

19、AM-1的影響及p38 MAPK信號(hào)通路在其中的作用。
　　方法:分離小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，第3至5代細(xì)胞被用來作為尼古丁暴露。用三種不同濃度的尼古丁進(jìn)行處理，濃度分別為10-5，10-6和10-7 M，實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露在10-6 M尼古丁的濃度下8個(gè)小時(shí)，ICAM-1和VCAM-1的活性達(dá)到了峰值。我們用10-6 M濃度的尼古丁進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分兩組，一組用10-6 M濃度的

20、尼古丁處理細(xì)胞，另一組用10μM濃度的p38MAPK抑制劑(SB203580)預(yù)處理小鼠的心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞30分鐘，然后再用10-6 M濃度的尼古丁處理細(xì)胞。處理后提取兩組細(xì)胞的RNA及蛋白，用qPCR及免疫印跡法比較兩組ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示尼古丁通過p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)肌肉Bmal1

21、的基因消融導(dǎo)致了代謝向脂肪氧化的方向轉(zhuǎn)移，減少了肌肉對(duì)糖的攝取和利用，引發(fā)了胰島素抵抗，缺少了正常狀態(tài)下能量代謝在休息/空腹?fàn)顟B(tài)下以脂肪代謝為主向活動(dòng)/飼喂?fàn)顟B(tài)下以糖代謝為主轉(zhuǎn)變的這一正常的生理現(xiàn)象，并促使肌纖維的組成類型發(fā)生了相應(yīng)的變化。肌肉中增強(qiáng)的脂肪氧化反過來阻止了肝臟中脂質(zhì)的聚集而促進(jìn)了脂肪組織中脂肪的動(dòng)員。由于過量的甘油供應(yīng)用于肝臟的糖異生而同時(shí)減少了肌肉中糖的利用，導(dǎo)致了循環(huán)中葡萄糖水平的升高而甘油三酯和游離脂肪酸的水平降低

22、，進(jìn)而抑制了高脂飲食導(dǎo)致的肥胖。
　　因此我們可以推斷Bmal1功能的增強(qiáng)可能會(huì)造成相反的結(jié)果，即胰島素敏感性增加，從而導(dǎo)致了糖利用增加，抑制了脂肪酸β-氧化，而體內(nèi)脂肪的過度積累造成了脂肪肝的形成及肥胖。
　　本研究通過觀察尼古丁對(duì)小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響，證明了10-6M的尼古丁在8小時(shí)時(shí)最大程度上增加了ICAM-1和VCAM-1在小鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。我們的結(jié)果提供了一個(gè)推定的機(jī)制

23、即尼古丁通過p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路刺激了這些粘附分子的表達(dá)。
　　綜上所述，Bmal1功能的缺失，將導(dǎo)致胰島素抵抗，升高循環(huán)中血糖的水平，而Bmal1功能的增強(qiáng)可能會(huì)抑制脂肪的氧化，導(dǎo)致循環(huán)中血脂水平增高及機(jī)體脂肪的蓄積，及無論Bmal1的功能是減低還是增強(qiáng)，都可能導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝的異常，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生;而尼古丁通過p38MAPK信號(hào)通路刺激了心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的增加，從而促發(fā)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反