長蠹科和長小蠹科昆蟲PCR-RDB鑒定技術(shù)及其分子系統(tǒng)進化研究.pdf

1、鞘翅目Coleoptera長蠹科Bostriychidae和長小蠹科Platypodidae昆蟲是一類具有經(jīng)濟意義的害蟲，其食性復雜，鉆蛀力強，具有較大的破壞性，能危害木材、藤枝、竹枝及其制品、樹木、經(jīng)濟作物和糧食及樓宇結(jié)構(gòu)等。上述兩科昆蟲主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，隨著國際貿(mào)易的快速增長，加速了其傳播擴散。我國口岸檢疫部門在進口的原木、木材及包裝材料上多次截獲到長蠹科和長小蠹科害蟲。為了防止外來物種入侵給我國林木造成重大經(jīng)濟損失，我國

2、將多種屬的長蠹、長小蠹列為植物檢疫性有害生物。由于檢疫截獲的蟲體中存在大量的幼蟲和蛹，其形態(tài)特征不明顯，難以進行種類鑒定，同時木材害蟲近緣種多，準確的形態(tài)鑒定需具備專業(yè)知識和鑒定經(jīng)驗，物種個體差異也常常導致鑒定結(jié)果不準確。本研究旨在應用一種新型分子生物學技術(shù)來解決這些問題。
　　 反向斑點雜交(Reversed dot blot，RDB)是一種基于PCR基礎之上的雜交技術(shù)，特異探針和目標基因PCR產(chǎn)物結(jié)合，通過類似酶聯(lián)免疫的方法

3、將雜交信號放大顯示出來。具有簡便、快速、靈敏度高、特異性和重復性好以及一次能檢測鑒定多個物種等技術(shù)特點。RDB技術(shù)已在醫(yī)學檢測和基因分型等領域有較廣泛的應用，但還未應用到昆蟲檢疫和鑒定中，檢測技術(shù)具有創(chuàng)新性。
　　 本研究選擇線粒體COⅠ基因作為研究目標基因，通過PCR、克隆和測序等分子生物學技術(shù)，獲得長蠹科、長小蠹科等22種昆蟲COⅠ基因序列。同時應用PCR-RDB技術(shù)，分別建立了長蠹科、長小蠹科昆蟲RDB種類檢測鑒定方法。昆

4、蟲PCR-RDB檢測在一小張Biodyne C尼龍膜上進行，按照預先設計的陣列，人工在膜上點上質(zhì)控探針(顯色點探針、陽性探針、陰性探針)和檢測探針，通過PCR、雜交、顯色和掃描等步驟以及質(zhì)控探針和檢測探針的顏色變化來判定目標害蟲的種類。
　　 PCR-RDB昆蟲檢測反應體系包括15-20pmol/μL探針濃度、42℃雜交3h，DNA模板100pg以上。共篩選出21條木材害蟲RDB種類鑒定特異探針，可實現(xiàn)9種長蠹、9種長小蠹及3種

5、小蠹昆蟲的種類鑒定；RDB靈敏度檢測能達到pg級。
　　 本研究還重點研究了長小蠹科5屬10種及長蠹科4屬9種mtDNA COⅠ基因部分序列(GenBank序列號GQ895744～GQ895760，HM002618～HM002631)。采用MEGA3.1分析了序列組成及遺傳距離，應用PAUP4.0分別構(gòu)建了長蠹科和長小蠹科NJ、MP及ML等三種分子系統(tǒng)樹，同時結(jié)合形態(tài)分類，探討各物種及所在屬的系統(tǒng)進化。結(jié)果表明：長小蠹科昆蟲在堿

6、基使用頻率上有很大的偏向性，A+T含量高達68.3％；長小蠹科與外群之間的遺傳距離(0.288～0.338)遠大于科內(nèi)種間距離(0～0.226)；Diapus屬分化最早，Euplatypus屬獨成一支，Treptohlatypus，Dinoplatypus和Platypus三屬分化為一支。長蠹科與外群之間的遺傳距離(0.229～0.348)遠大于科內(nèi)種間距離(0～0.259)；Xylothrips屬位于系統(tǒng)樹的一支；其余種為一大支，在這