無尾兩棲類MHC Ⅰ類基因的多態(tài)性及其進化機制.pdf

1、主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)是存在于脊椎動物中的一類具有極高多態(tài)性的基因家族。MHC基因編碼的細胞表面糖蛋白能將內源或外源性抗原呈遞到T淋巴細胞，因此MHC基因在脊椎動物的免疫系統(tǒng)中具有非常重要的作用?，F(xiàn)有的研究表明，MHC基因的多態(tài)性與抵御病原的能力存在相關性，是長期進化的結果，因此研究其進化能揭示MHC基因多態(tài)性的形成機制，有助于我們了解免疫相關蛋白的進化。現(xiàn)有對M

2、HC基因的多態(tài)性及進化機制的研究主要集中在哺乳類、魚類、鳥類等動物中，而對兩棲類MHC基因多態(tài)性及其進化機制尚不清楚。兩棲類在MHC基因進化中具有關鍵的地位，作為最早登陸的四足動物，其水陸兩棲的生活習性使其可能面臨更復雜的微生物環(huán)境。為更加系統(tǒng)、深入的了解兩棲類MHCⅠ類基因的多態(tài)性及其進化機制，本研究選擇了兩棲無尾類5個科（角蟾科、鈴蟾科、蟾蜍科、蛙科、樹蛙科）的9個物種——桑植角蟾（Megophrys sangzhiensis）、峨

3、眉髭蟾（Vibrissaphora boringii）、雷山髭蟾（Vibrissaphora leishanensis）、東方鈴蟾（Bombina orientalis）、中華蟾蜍（Bufo gargarizans）、澤陸蛙（Fejervaryalimnocharis）、黑斑側褶蛙（Pelophylax nigromaculata）、大樹蛙（Rhacophorusdennysi）和經(jīng)甫樹蛙（Rhscophorus Chenfui）為研究

4、對象，利用分子克隆和DNA測序的方法獲得MHCⅠ類基因的外顯子2-4的序列，分析其多態(tài)性，并解釋其進化的分子機制。
　　本研究利用RNA-Seq測序技術得到雷山髭蟾、桑植角蟾和大樹蛙等物種MHCⅠ類基因的部分序列開發(fā)了兩對引物，成功的克隆測序得到9個代表物種的MHCⅠ類基因的序列1800條序列，長度在730 bp左右，包含了完整的外顯子3和部分外顯子2和4。我們從9個代表物種90個個體的1800條序列中鑒定得到78個MHCⅠ類基因

5、的等位基因，其中經(jīng)甫樹蛙12個、大樹蛙9個、黑斑側褶蛙6個、澤陸蛙11個、中華蟾蜍8個、雷山髭蟾10個、峨眉髭蟾9個、桑植角蟾5個、東方鈴蟾8個。9個代表物種的不同個體檢測得到的等位基因存在差別，單個個體最多檢測得到4個等位基因，推測東方鈴蟾、雷山髭蟾、經(jīng)甫樹蛙、澤陸蛙和中華蟾蜍至少含有兩個MHCⅠ類基因座位，桑植角蟾、峨眉髭蟾、大樹蛙和黑斑側褶蛙至少含有一個MHCⅠ類基因座位。9個代表物種含有多基因座的現(xiàn)象說明兩棲類MHCⅠ類基因在進

6、化過程中曾發(fā)生過基因復制，符合脊椎動物MHC基因“出生-死亡”(Birth-and-death model)的進化假說。
　　9個代表物種的78個等位基因在氨基酸和核苷酸水平均呈現(xiàn)了高度的多態(tài)性，其中外顯子2和3的多態(tài)性明顯高于外顯子4的多態(tài)性，最高的是外顯子2，外顯子4的氨基酸序列相對于外顯子2和3最為保守。預示著除了基因復制外，平衡選擇和基因重組在兩棲類MHCⅠ類基因多態(tài)性的進化過程中起著非常重要的作用。
　　我們通過比

7、較不同外顯子的非同義突變率及同義突變率比值（dⅣ/ds）以及5種基于密碼子的模型（SLAC,REL，F(xiàn)EL，MEME，Codeml）對9個代表物種78個等位基因的序列進行了選擇作用的檢測，發(fā)現(xiàn)9個物種MHCⅠ類基因的氨基酸距離大于核苷酸距離，暗示著這些基因受到了選擇作用。而且，9個物種的MHCⅠ類基因的的大部分區(qū)域的非同義突變率及同義突變率比值是大于1，特別是抗原呈遞區(qū)域，這說明MHCⅠ類基因在進化過程中受到了正選擇的作用。通過5種模型

8、檢測到52個受到正選擇的氨基酸位點，這些位點多位于外顯子2和3區(qū)域，包括了10個推斷的抗原呈遞位點，這說明MHCⅠ類基因特別是抗原呈遞區(qū)域經(jīng)歷了較強烈的平衡選擇。通過建立兩棲類的MHCⅠ類基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)蛙科與樹蛙科的物種以及角蟾科內的物種存在跨物種多態(tài)性，進一步說明了兩棲類MHCⅠ類基因在進化過程中經(jīng)歷了平衡選擇。
　　同時，在這9個代表物種的MHCⅠ類等位基因中檢測到了多個重組現(xiàn)象的發(fā)生，78個等位基因中有37個等位基因

9、通過基因重組產(chǎn)生，重組位點多位于外顯子2及外顯子3和外顯子3及外顯子4交界處附近，類似于硬骨魚MHCⅠ類基因的重組模式。這個結果表明基因重組也是兩棲類MHCⅠ類基因進化的重要分子機制之一。
　　另外，我們通過建立MHCⅠ類等位基因的系統(tǒng)發(fā)育樹來比較不同物種的MHCⅠ類基因的發(fā)生關系，發(fā)現(xiàn)與其他脊椎動物相比，兩棲類MHCⅠ類基因的譜系比較古老。
　　總之，我們的結果表明兩棲類MHCⅠ類基因具有豐富的多態(tài)性，基因復制、平衡選擇和