基于介孔材料負(fù)載的光學(xué)免疫探針.pdf

1、本論文的研究工作中引入介孔SBA-15等納米粒子固定蛋白質(zhì),構(gòu)建新型化學(xué)發(fā)光和熒光免疫探針。主要研究工作如下:
　　 1.提出了一種基于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和酶標(biāo)抗體共同修飾的介孔SiO2納米粒子(HRP-Ab2/SiO2)作為超靈敏免疫探針的制備新方法,并成功應(yīng)用于人血清樣品中甲胎蛋白(AFP)的靈敏檢測(cè)。將AFP單抗固定在Au/SiO2介孔納米粒子修飾的玻片,作為一抗,HRP-Ab2/SiO2探針作為二抗,基于夾心式免疫

2、分析模式,檢測(cè)AFP的含量。介孔SiO2由于具有較大的比表面積和交錯(cuò)的多維孔道,可以大大提高生物分子的的負(fù)載量,使得在每個(gè)微球上能夠負(fù)載更多的HRP和AFP酶標(biāo)二抗,使魯米諾和H2O2的化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到放大,拓寬了檢測(cè)的線性范圍。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,AFP在0.01 to0.5 ng mL-1和0.5 to100 ng mL-1二段范圍內(nèi)呈線性相關(guān),檢測(cè)限為0.005 ng mL-1(3σ)。該免疫探針也可以應(yīng)用于其他抗原或其他生物活性

3、分子。
　　 2.將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和流動(dòng)注射技術(shù)相結(jié)合,基于藥物釋放原理,制備了一種基于底物魯米諾釋放的化學(xué)發(fā)光免疫探針,用于免標(biāo)記免疫測(cè)定AFP的含量。采用氯硅烷來(lái)封閉介孔SiO2外壁的羥基活性基團(tuán),減少外壁對(duì)蛋白質(zhì)或魯米諾底物的化學(xué)吸附;對(duì)介孔SiO2基的內(nèi)孔道則修飾羧基官能團(tuán),用于吸附大量的魯米諾,并用于后期固定AFP單克隆抗體,制備免標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫探針。通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH來(lái)調(diào)控魯米諾的釋放。當(dāng)免疫反應(yīng)結(jié)束后,形成的免疫復(fù)

4、合物由于空間位阻的增大,會(huì)影響魯米諾從孔道內(nèi)部向溶液中的擴(kuò)散,從而可以間接地定量溶液中抗原的含量。我們還對(duì)所制備的免疫探針進(jìn)行了臨床驗(yàn)證,表明該方法具有一定的準(zhǔn)確性。
　　 3.提出了一種基于介孔磁性材料(Fe3O4/SBA-15)的二組分化學(xué)發(fā)光免疫傳感系統(tǒng),用于同時(shí)檢測(cè)兩種重要的腫瘤標(biāo)志物:AFP和癌胚抗原(CEA)。采用具有較大的比表面積的介孔SiO2納米粒子負(fù)載更多的單抗和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)作為一抗,采用納米金粒子

5、負(fù)載抗原和Luminol底物分子來(lái)制備標(biāo)記抗原,采用競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)模式,來(lái)同時(shí)測(cè)定AFP和CEA的含量。加入待測(cè)抗原和標(biāo)記抗原,當(dāng)免疫反應(yīng)結(jié)束后,通入H2O2,在固定化HRP的催化作用下,在兩個(gè)檢測(cè)通道里分別產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)于AFP和CEA二種抗原的化學(xué)發(fā)光信號(hào),并在光門的輔助下分別檢測(cè)兩個(gè)通道中的信號(hào)。隨著樣品抗原濃度的增加,結(jié)合到流通池內(nèi)的標(biāo)記抗原的量就減少,化學(xué)發(fā)光信號(hào)也隨之下降,AFP在濃度為1.0-100 ng mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)

6、系,而CEA在濃度為1.0-80 ng mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢測(cè)限為0.2 ng mL-1(3σ)。
　　 4.提出了一種基于異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記熒光抗體修飾介孔SiO2的超靈敏標(biāo)記探針,并成功用于檢測(cè)人血清中甲胎蛋白(AFP)的含量。本方法通過(guò)EDC/NHS交聯(lián)劑將FITC標(biāo)記抗體固定在氨基功能化的介孔SBA-15上,制備得到抗體修飾介孔SBA-15的信號(hào)放大型熒光免疫探針(FITC-Ab*/SBA-15)。將

7、AFP單克隆抗體固定在納米金/介孔SBA-15修飾的玻璃片上,然后植入流動(dòng)注射體系,構(gòu)建免疫檢測(cè)流通池?；趭A心式免疫反應(yīng)模式,結(jié)合流動(dòng)注射分析技術(shù),待測(cè)抗原與FITC-Ab*/SBA-15順序注射到免疫流通池。免疫反應(yīng)結(jié)束后,FITC-Ab*/SBA-15被引入到流通池的玻璃載體表面,進(jìn)行熒光檢測(cè)。介孔SBA-15納米粒子由于具有較大的比表面積和交錯(cuò)的多維孔道,可以大大提高生物分子的的負(fù)載量,使得在每個(gè)微球上能夠負(fù)載更多的FITC標(biāo)記