降低SFRS10基因表達(dá)對(duì)小鼠AML-12細(xì)胞中SIRT1和Lipin-1表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的：
　　酒精性肝?。╝lcoholic liver disease, ALD）是指由于長(zhǎng)期飲酒或短期內(nèi)大量飲酒引起的肝損傷。其病因明確，但發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，尚未被完全闡明。我們團(tuán)隊(duì)前期通過酒精灌胃法建立大鼠ALD模型，發(fā)現(xiàn)酒精刺激后引起沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1, SIRT1)、精氨酸/絲氨酸剪接因子10(splicing factor, arginine/serine-rich10，SFRS10)的mRNA及蛋白表

2、達(dá)水平逐漸下降。SFRS10可以引起Lipin-1選擇性剪接，從而形成不同的異構(gòu)體。隨后我們?cè)诩?xì)胞水平，給予AML-12小鼠肝細(xì)胞梯度酒精刺激培養(yǎng)，建立酒精性肝細(xì)胞模型，并降低SIRT1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SIRT1低表達(dá)導(dǎo)致SFRS10表達(dá)水平下降，總Lipin-1及Lipin-1β表達(dá)水平升高，而Lipin-1α表達(dá)水平則顯著降低。本研究選用能代謝酒精的AML-12小鼠肝細(xì)胞，應(yīng)用SFRS10siRNA降低AML-12小鼠肝細(xì)胞內(nèi)SFRS10

3、表達(dá)，應(yīng)用油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；在細(xì)胞水平闡釋降低SFRS10表達(dá)對(duì)SIRT1和Lipin-1表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　復(fù)蘇小鼠AML-12細(xì)胞給予含10％胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1‰HEPES、1%青-鏈霉素抗體的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2，37℃恒溫條件下培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，降低SFRS10基因表達(dá)，分別設(shè)置空白對(duì)照組（Blank）、SFRS10siRNA陰性對(duì)照組（SFRS10siRNA NC）

4、、SFRS10siRNA組、SFRS10siRNA+酒精組。
　　陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別將SFRS10siRNA陰性無關(guān)對(duì)照序列、SFRS10siRNA轉(zhuǎn)染至AML-12細(xì)胞，空白對(duì)照組中加入等體積的脂質(zhì)體，培養(yǎng)4-6h后，更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至18-24小時(shí)， SFRS10siRNA+酒精組中加入120mM濃度的酒精，其余三組加入相同體積的生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。分別應(yīng)用RT-qPCR和Western blo

5、t法檢測(cè)SFRS10、SIRT1、Lipin-1、Lipin-1α、Lipin-1β的mRNA及蛋白表達(dá)水平；用4%多聚甲醛固定，給予行油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。
　　結(jié)果：
　　1降低小鼠AML-12細(xì)胞中SFRS10表達(dá)，通過RT-qPCR法檢測(cè)SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1α及Lipin-1βmRNA的表達(dá)水平，正常AML-12細(xì)胞SIRT1、SFRS10、細(xì)胞核內(nèi)Lipin-1α表

6、達(dá)水平相對(duì)較高，總Lipin-1及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Lipin-1β表達(dá)水平均較低；與空白對(duì)照組相比， SFRS10siRNA組SFRS10的表達(dá)顯著降低，SIRT1及總Lipin-1的表達(dá)水平無明顯變化（P均>0.05）；細(xì)胞質(zhì)中Lipin-1β表達(dá)水平明顯升高，而細(xì)胞核中Lipin-1α表達(dá)水平明顯降低（P均<0.01）；與SFRS10siRNA組比較，SFRS10siRNA+酒精組中，SFRS10、Lipin-1α表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P均<

7、0.01），SIRT1表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯降低（P<0.01），Lipin-1β表達(dá)水平進(jìn)一步上升，總Lipin-1表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯升高（P均<0.01）；與空白對(duì)照組相比 SFRS10siRNA NC組內(nèi)各指標(biāo)表達(dá)水平無明顯差異（P均>0.05）。降低SFRS10基因表達(dá)后，與空白對(duì)照組相比，SFRS10siRNA NC組無明顯變化（P>0.05），SFRS10siRNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高（P<0.01）；而且SFR

8、S10siRNA+酒精組，Lipin-1β/α的比值進(jìn)一步增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2降低SFRS10表達(dá)后，通過Western blot法檢測(cè)SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1β及Lipin-1α的蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)與RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果一致：正常AML-12細(xì)胞中SIRT1、SFRS10和Lipin-1α蛋白表達(dá)水平較高，而Lipin-1及Lipin-1β表達(dá)水平較低；與空白

9、對(duì)照組相比， SFRS10siRNA組中SFRS10的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞質(zhì)中Lipin-1β表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞核中Lipin-1α表達(dá)水平明顯降低（P均<0.01），而SIRT1及總Lipin-1的表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）；SFRS10siRNA+酒精組中， SFRS10、Lipin-1α表達(dá)水平進(jìn)一步下降（P均<0.01）；SIRT1表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯降低（P<0.01）；細(xì)胞質(zhì)中Lipin-1β表達(dá)水平進(jìn)一步升高，總L

10、ipin-1表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯升高（P均<0.01）；與空白對(duì)照組相比， SFRS10siRNA陰性對(duì)照組中各個(gè)指標(biāo)表達(dá)無明顯差異（P均>0.05）。降低SFRS10表達(dá)后，與空白對(duì)照組相比，SFRS10siRNA NC組無明顯變化（P>0.05）， SFRS10siRNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高（P<0.01）；SFRS10siRNA+酒精組，Lipin-1β/α的比值進(jìn)一步增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

11、　　3通過油紅O染色法觀察小鼠AML-12細(xì)胞，比較各組間脂質(zhì)變化情況，我們發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組中AML-12細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂肪變性；通過基因工程技術(shù)降低SFRS10表達(dá)后，SFRS10siRNA組中AML-12細(xì)胞內(nèi)可見較多的紅色脂滴；而 SFRS10siRNA+酒精組中AML-12細(xì)胞內(nèi)可見大量的紅色脂滴。
　　結(jié)論：
　　SFRS10表達(dá)降低對(duì)SIRT1無顯著影響，它可能作為上游因子通過調(diào)節(jié)Lipin-1的選擇