華鉤藤的分子鑒定及SGM融合子分離純化.pdf

1、本文分為兩部分，第一部分主要對華鉤藤的分子鑒定；第二部分圍繞SGM代謝產物抑菌活性成分展開研究。SGM是由粘質沙雷氏菌與紅酵母通過原生質體跨界融合獲得的微生物，其粗提物對芽孢桿菌具有較好的抑菌活性。課題在對SGM分子鑒定的基礎上，通過分離純化和結構鑒定技術對SGM代謝產生的抑菌活性物質開展研究。主要研究內容如下：
　　1.華鉤藤的分子鑒定。使用擴增ITS區(qū)序列的通用引物ITS4/ITS5對華鉤藤的核酸序列進行擴增。通過同源性比對，

2、鉤藤樣品跟GenBank中已有的華鉤藤(U.sinensis FJ980386)相似性達99.8％。
　　2.SGM的分子鑒定。使用擴增真菌rDNA的內轉錄間隔區(qū)（ITS區(qū)）序列的通用引物ITS4/ITS5和擴增細菌的16S rRNA序列的通用引物27f/1492r對融合子的核酸序列進行擴增。通過同源性比對，其中ITS基因與紅酵母同個基因序列的相似性分別為100%；16SrRNA基因與粘質沙雷氏菌同個基因序列的相似性分別為96%。

3、
　　3.SGM培養(yǎng)條件的優(yōu)化。以生物量和抑菌圈大小作為指標考察培養(yǎng)基碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對SGM生長代謝的影響。試驗結果表明使用蔗糖和牛肉膏分別作為碳源、氮源時SGM的生物量和抑菌活性優(yōu)于使用其他碳源和氮源。以蔗糖含量為1.5%、牛肉膏含量0.8%、30℃培養(yǎng)60h為SGM培養(yǎng)最佳條件，SGM的生物量OD600（稀釋20倍）為0.631、濕重為62g，代謝產物粗提物抑菌圈直徑為15.7mm。
　　4.建立SGM提

4、取物抑菌活性的檢測方法，同時對SGM發(fā)酵液粗提物抑菌活性及其穩(wěn)定性進行研究。經試驗篩選枯草芽孢桿菌為受試菌，受試菌濃度為5x105cuf/mL，加藥量為30L。穩(wěn)定性試驗結果表明SGM發(fā)酵液粗提物對溫度（30～121℃）、加熱時間（15～75min）、反復凍融（2～40次）穩(wěn)定性較好。SGM粗提物相對濃度的對數與抑菌圈直徑的回歸方程為y=125.34x+194.68（r=0.995）符合抗生素經典作用方程。
　　5.部分抑菌活性物

5、質的鑒定。通過對SGM代謝產物的不同萃取層抑菌活性的追蹤，根據抑菌活性物質所在的萃取部位建立分離方法，采用硅膠柱層析、Sephadex LH20凝膠柱層析分離純化得到四個化合物，并通過UV、MS、NMR鑒定它們分別為：腺苷、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、麥角甾醇、過氧化麥角甾醇。實驗條件下DBP對枯草芽孢桿菌的MIC為10mg/mL，對大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌均未表現(xiàn)出抑制作用，腺苷和麥角甾醇未表現(xiàn)出抑菌作用；過氧化麥角甾大腸桿菌、枯草芽