霉茶總黃酮和蛋白合用對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的保護(hù)作用及機制研究.pdf

1、目的：應(yīng)用霉茶總黃酮、霉茶蛋白合用對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）進(jìn)行干預(yù)，觀察霉茶總黃酮、霉茶蛋白合用對SHR腎臟的影響，及TLR4信號通路及RAS系統(tǒng)在其中的作用，再通過NRK-52E細(xì)胞系對TLR4信號通路在其中的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　方法：
　　1、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用對SHR腎臟的影響
　　40只SHR分為SHR組，霉茶總黃酮組，霉茶蛋白組，霉茶總黃酮和蛋白合用組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)及血壓測量訓(xùn)練3 W后，S

2、HR組大鼠灌胃給予等容量蒸餾水，灌胃容量為10 mL?kg-1體重，霉茶總黃酮組劑量為180 mg?kg-1，霉茶蛋白組劑量為70 mg?kg-1，合用組劑量為（180 mg?kg-1+70 mg?kg-1）。各組大鼠每天灌胃給藥2次，連續(xù)灌胃7周，尾動脈無創(chuàng)測壓法每周測量大鼠血壓并記錄，于末次給藥后1h處死大鼠，迅速鈍性剝離腎臟組織，取部分腎臟組織4％多聚甲醛固定，HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。
　　2、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合

3、用對SHR腎臟保護(hù)作用的機制研究
　　2.1霉茶總黃酮和蛋白合用對SHR腎臟的TLR4信號通路的影響
　　分組和給藥方法同1項。大鼠處死后迅速鈍性剝離腎臟組織，用濾紙吸干水分，取部分組織-80℃保存，一部分通過實時熒光定量PCR法檢測腎臟組織基因TLR-4、NF-κB、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量。另一部分通過免疫印跡蛋白分析法檢測腎臟組織TLR-4和NF-κB蛋白的表達(dá)。
　　2.2霉茶總黃酮和蛋白合用對SH

4、R的RAS系統(tǒng)的影響
　　分組和給藥方法同1項。大鼠處死后迅速鈍性剝離腎臟組織，用濾紙吸干水分，取部分組織-80℃保存，作為實時熒光定量PCR實驗樣本，檢測腎臟組織基因ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達(dá)量。
　　3、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用對腎小管上皮細(xì)胞TLR4信號通路的影響
　　大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）在含5%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取NRK-52E接種

5、6孔板，培養(yǎng)24h后，采用10-6 mol/l濃度的AngⅡ刺激腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)24h，后按（正常對照組、AngⅡ組、AngⅡ+霉茶總黃酮組、AngⅡ+霉茶蛋白組、AngⅡ+霉茶總黃酮+蛋白合用組分組方式加入對應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，一部分提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平。一部分提取蛋白，采用免疫印跡蛋白分析檢測TLR4和NF-κB的蛋

6、白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠體重、血壓、腎臟指數(shù)變化：至實驗結(jié)束時，各組間大鼠的體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。與SHR組比較，霉茶總黃酮組、霉茶蛋白組及合用組均可明顯降低 SHR的血壓（P＜0.01）。霉茶總黃酮和霉茶蛋白并沒有使SHR的腎臟指數(shù)發(fā)生改變。
　　2、腎臟病理學(xué)改變：HE染色顯示，SHR組大鼠腎小球毛細(xì)血管淤血擴(kuò)張，腎小球旁有炎性細(xì)胞灶性浸潤，腎小管旁血管淤血擴(kuò)張，經(jīng)霉茶總黃酮和霉茶蛋白干預(yù)后，炎癥浸

7、潤明顯減輕，且較少的毛細(xì)血管擴(kuò)張，合用組無明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象。
　　3、腎臟組織中RAS系統(tǒng)相關(guān)成分的mRNA表達(dá)改變情況：與SHR組比較，霉茶總黃酮組 AngⅡ的 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，同時ACE和CYP11B2的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；合用組ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；而霉茶蛋白組的給藥作用并不明顯。說明霉茶總黃酮和合用組能下調(diào) SHR大鼠腎臟組織

8、中ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達(dá)。同時，合用組與霉茶總黃酮組比較，ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，說明霉茶總黃酮與蛋白合用后，效果優(yōu)于其單用。
　　4、腎臟組織中TLR4及相關(guān)炎性因子的表達(dá)改變情況：與SHR組比較，霉茶總黃酮組和合用組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；而霉茶蛋白組的給藥作用并不明顯。說明霉茶總黃酮和合用

9、組能下調(diào)SHR腎臟組織中基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)。同時，與霉茶總黃酮組比較，合用組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，說明霉茶總黃酮與蛋白合用后，有一定的協(xié)同作用，效果優(yōu)于其單用。與SHR組比較，霉茶蛋白組、霉茶總黃酮組和合用組TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；同時，合用組與霉茶蛋白組比較TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)量明顯降

10、低(P<0.01)，表明霉茶總黃酮與蛋白合用效果優(yōu)于單用。
　　5、腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)中TLR4及相關(guān)因子的表達(dá)改變情況：與正常對照組比較，AngⅡ組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。與 AngⅡ組比較，霉茶總黃酮組基因 TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，霉茶蛋白組和合用組TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a

11、的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。且合用組與霉茶總黃酮組比較，基因TLR4、NF-κB和IL-6的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.01)， TNF-a的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。表明霉茶總黃酮與蛋白合用后，效果優(yōu)于單用。與正常對照組比較，AngⅡ組細(xì)胞TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)明顯增高(P<0.01)。與AngⅡ組比較，霉茶總黃酮TLR4蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，NF-κB蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.

12、01)；霉茶蛋白組和合用組細(xì)胞 TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。且合用組分別與霉茶總黃酮組和蛋白組比較,細(xì)胞 TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。說明霉茶總黃酮與蛋白合用效果優(yōu)于單用。
　　結(jié)論：
　　1、霉茶總黃酮和蛋白合用對SHR腎臟有一定的保護(hù)作用。
　　2、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用保護(hù)腎臟的作用機制可能與其下調(diào)腎臟組織中基因 ACE、AngⅡ和 CYP11B2的