兩種藥用植物響應光酶誘導次生代謝關鍵酶活性的研究.pdf

1、課題組前期研究表明，應用光酶誘導技術可以顯著提高藥用植物體內(nèi)活性成分的含量，或者產(chǎn)生新的高活性的次生代謝產(chǎn)物。本課題以圓錐鐵線蓮葉片和桑葉為研究對象，應用光酶誘導技術誘導圓錐鐵線蓮葉片產(chǎn)生香豆素，誘導桑葉產(chǎn)生桑辛素和Diels-Alder加合物。從這兩種藥用植物葉片中提取粗酶，分別加入香豆素和Diels-Alder加合物生物合成途徑的前體，輔以HPLC-DAD分析技術，確認了生物合成活性成分關鍵酶的存在，從酶學水平闡釋了光酶誘導技術提高

2、藥用植物體內(nèi)活性成分含量的作用機制。
　　以圓錐鐵線蓮葉為研究對象，將離體的圓錐鐵線蓮葉片進行光酶誘導處理，誘導后樣品在溫度25℃，避光培養(yǎng)，時間分別為6h、12h、18h、24h和36h，對照組樣品也在同樣環(huán)境下培養(yǎng)36h。采用不同pH值的提取液從圓錐鐵線蓮葉片中提取粗酶，加入推測的香豆素生物合成途徑的前體，進行酶促反應。當加入推測的底物p-香豆酸，7-羥基香豆素，水楊酸和苯甲酸之后，底物沒有消耗，也沒有合成新的化合物，而當加入

3、咖啡酸之后，體系有新的色譜峰產(chǎn)生;從不同時間點提取出來的粗酶的活性各不相同，但都能催化咖啡酸發(fā)生反應。催化此反應的酶在對照組的葉片中也能檢測到，活性較處理組低?？梢猿醪脚袛?，光酶誘導圓錐鐵線蓮產(chǎn)生的三個香豆素化合物，可能是通過咖啡酸途徑生物合成的，是生物合成上游的限速步驟。
　　以桑葉為研究對象，將離體的桑葉葉片進行光酶誘導處理，誘導后樣品在溫度為25℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為36h，對照組的樣品也在同樣環(huán)境下培養(yǎng)。采用pH=8

4、的提取液從桑葉中提取粗酶，加入推測的Diels-Alder加合物的生物合成途徑的前體，進行酶促反應，分析反應前后指紋圖譜的變化，確定桑葉體內(nèi)存在Diels-Alderase，光酶誘導前后桑葉提取的粗酶，加入預測的底物morachalcone和桑辛素C，在酶促反應開始的2h內(nèi)，酶促反應進行非常順利，生成了預測的Diels-Alder加合物chalcomoracin，并且隨著恒溫孵育時間的延長，morachalcone和桑辛素C逐漸消耗掉，

5、而chalcomoracin含量則隨之顯著上升。研究顯示光酶誘導前后的桑葉都存在著Diels-Alderase，能夠催化morachalcone和桑辛素C生物合成chalcomoracin，并且該酶的活性較高。然而，預測底物morachalcone和桑辛素N沒有發(fā)生上述生物合成反應。由此可以推測，Diels-Alderase具有高度特異性，僅能催化特定結構的底物發(fā)生[4+2]環(huán)加成反應。
　　采用光酶誘導技術能使誘導后的藥用植物產(chǎn)