動脈粥樣硬化大血管和微血管病變的干預(yù)靶點研究.pdf

1、論文Ⅰ氧化型低密度脂單白和他汀類藥物對P4Hα1作用分子機制研究
　　1研究背景
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)不僅可以累及體循環(huán)的大中動脈也可累及前小動脈和小動脈導(dǎo)致微血管病變，這些血管病變可引起多個器官的形態(tài)和功能異常，其中，心、腦、腎是主要的AS靶器官，可導(dǎo)致心肌梗死、缺血性心肌病，腦卒中和慢性腎病，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭和死亡。因此，深入研究AS大血管和微血管病變的發(fā)生機制和干預(yù)靶點，對于A

2、S的防治具有重要的理論和實際意義。
　　九十年代以來大量研究顯示，AS易損斑塊的形成是急性心腦血管事件的主要原因，因此，斑塊易損性也成為國內(nèi)外研究的熱點，其主要的病理學(xué)特點包括較薄的纖維帽，較大的脂質(zhì)核心和大量炎性細胞浸潤。由于膠原是纖維帽的主要構(gòu)成成分，因此斑塊內(nèi)膠原代謝紊亂是影響斑塊易損性的重要因素。
　　4-羥基-脯氨酸羥化酶(P4H)是所有已知類型的膠原合成過程中的關(guān)鍵酶，能夠催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-

3、Gly)重復(fù)序列中的脯氨酸變?yōu)榱u脯氨酸，該反應(yīng)在前膠原多肽鏈折疊成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮重要作用。P4H的同工酶P4Hα1在多種組織中均有表達，其表達減少可導(dǎo)致斑塊內(nèi)膠原含量減少，進而導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定，因而是決定斑塊穩(wěn)定性的重要因素。既往研究發(fā)現(xiàn)多種因素均能影響P4Hα1的表達，例如TGFβ1能夠上調(diào)P4Hα1的表達而吸煙可抑制其表達;本實驗室也曾發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α和IL-6分別通過ASK1-JNK-NonO和ERK1/2-

4、Sp1信號通路抑制P4Hα1的表達。
　　氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL)是動脈粥樣硬化形成和發(fā)展過程中的重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL能夠激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)，增加膠原降解，進而誘導(dǎo)斑塊不穩(wěn)定。但是，ox-LDL能否通過調(diào)節(jié)P4Hα1的表達進而調(diào)節(jié)膠原合成目前尚未見報道。他汀類藥物不僅具有降脂作用，還具有

5、多種有益于心血管疾病的作用。大量研究證實他汀類藥物能夠增加斑塊內(nèi)膠原含量進而增加斑塊穩(wěn)定性，其機制為他汀類藥物抑制MMPs的表達和活性以及增加了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissueinhibitorsofmetalloproteinase-1，TIMP-1)的表達。然而，他汀類藥物能否通過調(diào)節(jié)P4Hα1的表達進而調(diào)節(jié)膠原合成目前尚未見報道。
　　2研究目的
　　(1)探討ox-LDL對P4Hα1的抑制作用及其機制并探

6、討辛伐他汀的干預(yù)作用;
　　(2)觀察辛伐他汀干預(yù)對斑塊內(nèi)P4Hα1表達的影響及并探討其機制，揭示他汀類藥物穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的新靶點。
　　3實驗方法
　　3.1細胞培養(yǎng)與處理
　　(1)在時間-效應(yīng)實驗中，我們用50ug/ml的ox-LDL刺激平滑肌細胞0、4、8、12和24小時，為保證ox-LDL不至于因為刺激時間過長而降解或者失活，每隔8小時更換含有50μg/ml的ox-LDL的新鮮培養(yǎng)基;在劑量-效應(yīng)

7、實驗中，0、25、50ug/ml的ox-LDL分別刺激平滑肌細胞8小時，收集細胞。
　　(2)50ug/ml的ox-LDL或者50ug/ml的ox-LDL+辛伐他汀分別刺激細胞0分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、2小時、4小時和8小時，檢測MAPK的激活。我們應(yīng)用MAPK的抑制劑以及MAPK的小分子干擾RNA處理細胞，然后應(yīng)用50ug/ml的ox-LDL刺激細胞8小時，收集細胞。
　　(3)在正常培養(yǎng)基或者ox-LDL刺激條

8、件下，辛伐他汀干預(yù)細胞進行相關(guān)檢測。
　　3.2動物模型的建立
　　120只8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為兩組—普通飲食組(n=40)和高脂飲食組(n=80)。2周后，所有小鼠均給予右側(cè)頸總動脈套管以促進AS斑塊形成。套管術(shù)后6周，普通飲食組隨機分為兩組(每組20只)—Mock1組(0.5％methylcellulose單獨灌胃)和Sim1組（辛伐他汀溶于0.5％甲基纖維素，50mg/kg·d量灌胃）;高脂飲食組隨機分

9、為四組(每組20只)—Mock2組（0.5％甲基纖維素單獨灌胃），SB組(p38MAPK抑制劑SB203580，2mg/kg·d腹腔注射)，PD組(ERK1/2抑制劑PD98059，2mg/kg·d腹腔注射)，Sim2組（辛伐他汀溶于0.5％甲基纖維素，50mg/kg·d量灌胃）。治療6周后對小鼠稱重行安樂死。
　　3.3RT-PCR
　　收集細胞，提取mRNA，檢測P4Hα1mRNA水平。
　　3.4Westernb

10、lot
　　收集細胞和頸動脈斑塊組織，提取蛋白，檢測P4Hα1、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原、P-/T-p38MAPK、P-/T-JNK、P-/T-ERK1/2的表達。
　　3.5ELISA
　　收集細胞上清，ELISA試劑盒檢測上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量。
　　3.6DiI-ox-LDL攝取實驗
　　DiI-ox-LDL刺激細胞8小時，激光共聚焦照相觀察細胞攝取情況。
　　3.7血脂檢測
　　動物試驗結(jié)

11、束前，收集小鼠空腹血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。
　　3.8H&E、油紅O、天狼猩紅染色以及MOMA-2、α-SMactin和ox-LDL的免疫組化染色
　　制備頸動脈斑塊冰凍組織切片，行H&E染色觀察大體形態(tài)，油紅O染色檢測脂質(zhì)含量，天狼猩紅染色檢測膠原含量，MOMA-2和α-SMactin染色分別檢測巨噬細胞和平滑肌細胞含量，計算易

12、損指數(shù)。免疫組化染色檢測斑塊內(nèi)ox-LDL的含量。
　　4結(jié)果
　　4.1細胞實驗
　　4.1.1ox-LDL對P4Hα1的抑制作用
　　在時間-效應(yīng)實驗中，50ug/ml的ox-LDL能夠抑制P4Hα1的表達，在8小時時間點達到最大抑制效應(yīng);在劑量-效應(yīng)實驗中，隨著ox-LDL濃度升高，P4Hα1的mRNA和蛋白水平呈遞減趨勢，在50ug/ml達到最大抑制效應(yīng)。我們也應(yīng)用Westernblot和ELISA檢測了

13、ox-LDL刺激細胞8小時后膠原的含量，結(jié)果顯示ox-LDL顯著抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達和分泌。
　　4.1.2ox-LDL通過激活p38MAPK和ERK1/2信號通路發(fā)揮抑制作用
　　Ox-LDL刺激平滑肌細胞0分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、2小時、4小時和8小時，檢測MAPK激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平在5分鐘達高峰，之后雖然逐漸減弱，但在8小時仍顯著高于0分鐘時，說明ox-LDL對其激活可持

14、續(xù)至8小時。但是，ox-LDL對JNK的磷酸化水平無明顯影響。應(yīng)用p38MAPK、JNK和ERK1/2的抑制劑或者siRNA處理細胞，然后應(yīng)用ox-LDL刺激細胞檢測P4Hα1的表達，發(fā)現(xiàn)抑制或基因沉默p38MAPK和ERK1/2后ox-LDL對P4Hα1的抑制作用明顯減弱，而JNK的阻斷或者基因沉默對P4Hα1的表達無顯著影響。
　　4.1.3辛伐他汀逆轉(zhuǎn)ox-LDL對P4Hα1的抑制作用
　　辛伐他汀不能改變正常情況下平

15、滑肌細胞P4Hα1的表達水平，但是可以顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL刺激細胞對P4Hα1的抑制效應(yīng)，相應(yīng)的增加了膠原的合成。探討其機制發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠減少細胞對ox-LDL的攝取，抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化。
　　4.2動物實驗
　　4.2.1動物體重及血脂水平
　　各組ApoE-/-小鼠的體重?zé)o顯著差異。高脂飲食小鼠TC、TG、LDL-C較普通飲食小鼠顯著升高而HDL-C顯著降低;高脂飲食組內(nèi)的四個亞組間各血脂指

16、標無顯著差異。
　　4.2.2辛伐他汀、SB203580和PD98059增加AS斑塊穩(wěn)定性普通飲食組內(nèi)，辛伐他汀干預(yù)未顯著改變斑塊的易損指數(shù)。與Mock1組相比，Mock2組AS斑塊的易損指數(shù)顯著升高，提示動脈粥樣硬化易損斑塊造模成功。在高脂飲食組內(nèi)，辛伐他汀、SB203580和PD98059干預(yù)能夠顯著降低斑塊的易損指數(shù)。
　　4.2.3辛伐他汀上調(diào)不穩(wěn)定斑塊內(nèi)P4Hα1
　　與Mock1相比，Mock2組P4Hα1

17、的表達水平顯著降低，提示不穩(wěn)定斑塊內(nèi)P4Hα1生成減少。在普通飲食組內(nèi)，辛伐他汀干預(yù)未明顯改變P4Hα1的表達。但是，在高脂飲食組內(nèi)，辛伐他汀、SB203580和PD98059干預(yù)顯著增加斑塊內(nèi)P4Hα1的表達水平。與Mock2組相比，辛伐他汀治療還能夠降低斑塊內(nèi)ox-LDL的含量，抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化。
　　5結(jié)論
　　(1)ox-LDL通過激活p38MAPK和ERK1/2信號通路抑制P4Hα1和膠原的

18、合成。
　　(2)他汀類藥物能夠逆轉(zhuǎn)ox-LDL對P4Hα1的抑制作用，其機制是他汀類藥物減少了細胞對ox-LDL的攝取，抑制p38MAPK和ERK1/2的激活。
　　(3)在ApoE-/-小鼠模型中，他汀類藥物可增加AS斑塊內(nèi)P4Hα1的表達和膠原合成，達到穩(wěn)定斑塊的作用。本研究揭示了他汀類藥物穩(wěn)定斑塊的新的干預(yù)靶點，具有重要的學(xué)術(shù)意義。
　　論文ⅡNonO在動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性中的作用及機制研究
　　1研究

19、背景
　　急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)是引起急性心腦血管事件的主要原因。目前已證實動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)易損斑塊破裂是ACS發(fā)病的始動環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)易損斑塊具有以下特點:較大的脂核、較薄的纖維帽、多種炎癥細胞聚集以及斑塊內(nèi)膠原合成降解失衡。其中，膠原代謝是影響斑塊穩(wěn)定性的重要原因。
　　4羥基-脯氨酸羥化酶(P4H)是所有已知的21種膠原合成過程中的關(guān)鍵酶

20、，能夠催化X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重復(fù)序列中的脯氨酸變?yōu)榱u基脯氨酸，從而促進前膠原多肽鏈折疊成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。作為P4H的同工酶，P4Hα1是膠原合成過程中的重要限速酶。抑制P4Hα1的表達可減少AS斑塊內(nèi)膠原合成，進而導(dǎo)致易損斑塊形成;與之相反，過表達P4Hα1則會促進膠原的合成。既往研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1能夠促進P4Hα1的表達而吸煙可抑制其表達。近年來，本實驗室張澄等研究發(fā)現(xiàn)在人類主動脈平滑肌細胞中，TNF-α具有抑

21、制P4Hα1表達的作用，并提出了完整的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即ASK1-MKK4-JNK1-NonO，首次提出NonO是P4Hα1合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)膠原合成過程中發(fā)揮重要作用，但是目前尚缺乏動物實驗驗證。
　　NonO（即人類的p54nrb蛋白）是一個大小為54KDa并在體內(nèi)廣泛表達的蛋白，是一個無POU結(jié)構(gòu)域的八聚體結(jié)合蛋白，NonO含有兩個核酸結(jié)合域，可直接與DNA結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控;另外，NonO也可與其他轉(zhuǎn)錄蛋白相互作用調(diào)節(jié)基

22、因表達。如前所述，本實驗室研究發(fā)現(xiàn)NonO是P4Hα1合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)膠原合成過程中發(fā)揮重要作用。既往研究還發(fā)現(xiàn)NonO參與調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)信號通路，而該信號通路可參與炎癥反應(yīng)，促進TNF-α、IL-2、IL-6等炎癥因子的表達;另外，NonO能夠參與COX-23'-UTR的多聚腺苷酸化，影響其轉(zhuǎn)錄，而COX-2亦參與了炎癥反應(yīng)和AS的進展。上述研究提示Non

23、O可能參與調(diào)節(jié)膠原代謝和炎癥反應(yīng)。綜合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，NonO在AS中的作用研究尚未明確。對于大多數(shù)急性心血管事件來說，易損斑塊的穩(wěn)定性是影響事件的決定性因素，但目前，NonO是否影響易損斑塊的穩(wěn)定性尚無報道。
　　2研究目的
　　(1)體內(nèi)實驗中，通過過表達和基因沉默NonO觀察NonO對易損斑塊破裂率的影響以及斑塊內(nèi)成分的改變。
　　(2)體外實驗中，通過過表達和基因沉默NonO探討NonO穩(wěn)定斑塊的分子機制。

24、r>　　3方法
　　3.1NonO干擾及過表達慢病毒載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建三個干擾(si-A、si-B、si-C)和一個過表達NonO的慢病毒載體，以攜帶亂序siRNA的慢病毒載體作為干擾對照，以只攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體作為過表達對照。轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞篩選最佳的干擾序列以及驗證攜帶NonO基因的慢病毒的過表達效果。
　　3.2動物模型的建立
　　(1)20只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)2周

25、后，隨機分為兩組:Control組(n=10):無頸動脈套管及精神應(yīng)激;Mock組(n=10):行頸動脈套管手術(shù)，手術(shù)8周后行精神應(yīng)激，具體方法如下:將ApoE-/-小鼠置于容積為50ml、帶有通氣孔的塑料針管中，同時進行噪音刺激。噪音刺激強度為110dB，每5分鐘一次，每次持續(xù)3秒。每天持續(xù)6小時，共應(yīng)激四周。實驗第14周末，ApoE-/-小鼠被處以安樂死。
　　(2)為觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率及時間變化，15只ApoE-/-小鼠行頸

26、動脈套管手術(shù)后八周，頸動脈局部轉(zhuǎn)染攜帶GFP基因的慢病毒，并分別于轉(zhuǎn)染前(n=5)、轉(zhuǎn)染pGC-GFP-LV后2周(n=5)和轉(zhuǎn)染pGC-GFP-LV后4周(n=5)進行取材，觀察各個時間點慢病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　(3)8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)2周后，右側(cè)頸總動脈套管誘導(dǎo)AS斑塊形成。頸總動脈套管手術(shù)8周后，根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同，將ApoE-/-小鼠隨機分為5組:(1)Control組（不加干預(yù)）;(2)si-N.C組（轉(zhuǎn)

27、染攜帶亂序siRNA的慢病毒）;(3)si-NonO組（轉(zhuǎn)染攜帶si-NonO的慢病毒）;(4)N.C組（轉(zhuǎn)染只攜帶GFP的慢病毒）;(5)NonO組（轉(zhuǎn)染攜帶NonO基因的慢病毒）。轉(zhuǎn)染后第3天開始應(yīng)激刺激，刺激方法同前。實驗第14周末，ApoE-/-小鼠被處以安樂死。
　　3.3體重及血脂的檢測
　　實驗開始前和14周末對所有ApoE-/-小鼠行體重測量，每只小鼠測量3次后取其平均值。實驗14周末穿刺左心室采血，常溫靜置

28、30分鐘以后置于離心機中3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上層血清，酶法檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的濃度。
　　3.4組織病理學(xué)的檢測
　　制備右側(cè)頸總動脈切片，對頸總動脈斑塊進行H&E、油紅O和天狼猩紅染色并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測頸總動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞、平滑肌細胞、IL-1β、IL-6、MMP-2和MMP-9的含量，計算易損指數(shù)。
　

29、　3.5細胞培養(yǎng)
　　(1)在時間梯度實驗中，RAW264.7細胞應(yīng)用100ng/ml的TNF-α分別刺激0、6、12、24和48h;在劑量梯度實驗中，我們應(yīng)用0、25、50和100ng/ml的TNF-α刺激RAW264.7細胞24h。收集細胞提取蛋白檢測NonO表達水平。
　　(2)根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同，將細胞分為5組:①Control組:不加任何干預(yù);②si-N.C組:轉(zhuǎn)染攜帶亂序siRNA的慢病毒;③si-NonO組:轉(zhuǎn)

30、染攜帶si-NonO的慢病毒;④N.C組:轉(zhuǎn)染只攜帶GFP的慢病毒;⑤NonO組:轉(zhuǎn)染攜帶NonO基因的慢病毒。100ng/ml的TNF-α刺激24小時，收集細胞。
　　3.6實時定量PCR
　　收集右側(cè)頸總動脈組織，提取mRNA，檢測頸動脈斑塊內(nèi)NonO、MMP-2和MMP-9的mRNA水平。
　　3.7Westernblot
　　收集右側(cè)頸總動脈斑塊組織和細胞，提取蛋白，檢測頸動脈斑塊內(nèi)NonO、MMP-2、

31、MMP-9、P4Hα1、LOX-1、COX-2以及平滑肌細胞內(nèi)NonO、MMP-2、MMP-9、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、p/t-NF-κBp65以及IκBα的蛋白表達水平。
　　3.8細胞免疫熒光化學(xué)
　　細胞免疫熒光化學(xué)法檢測五組RAW264.7細胞內(nèi)NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。
　　3.9免疫共沉淀
　　收集細胞蛋白，檢測TNF-α刺激RAW264.7細胞后NonO與NF-κB的結(jié)合情

32、況。
　　4結(jié)果
　　4.1AS斑塊內(nèi)以及TNF-α刺激的RAW264.7內(nèi)NonO的表達水平
　　在體內(nèi)實驗中，與Control組正常的頸動脈相比，Mock組小鼠頸動脈斑塊內(nèi)NonOmRNA及蛋白表達顯著升高，提示NonO在斑塊進展中可能發(fā)揮作用。
　　在體外實驗中，時間梯度實驗顯示100ng/mlTNF-α能上調(diào)NonO的表達，在24小時達到最大效應(yīng);濃度梯度實驗顯示10ng/mlTNF-α刺激24小時便能顯

33、著提高NonO的表達，在100ng/ml時達最大效應(yīng)。
　　4.2RAW264.7細胞中慢病毒干擾及過表達NonO的效率和效果
　　將N.C、si-A、si-B、si-C及NonO-LV分別轉(zhuǎn)染小鼠RAW264.7細胞，轉(zhuǎn)染4天后觀察慢病毒攜帶的報告基因GFP的表達情況，發(fā)現(xiàn)感染效率均大于70％進而收集細胞提取蛋白質(zhì)進行檢測。結(jié)果表明，si-A、si-B、si-C轉(zhuǎn)染致NonO蛋白表達分別減少57％、43％和44％，進而篩選

34、出最有效的干擾位點si-A用于隨后動物和細胞實驗中si-NonO組的轉(zhuǎn)染;而NonO-LV轉(zhuǎn)染細胞能夠使NonO蛋白水平較Control組增加70％，用于隨后動物和細胞實驗中NonO組的轉(zhuǎn)染。
　　4.3慢病毒在頸動脈斑塊的轉(zhuǎn)染效率
　　在頸動脈斑塊局部轉(zhuǎn)染慢病毒開始前、2周末和4周末取材，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染兩周后GFP顯著表達，然后開始衰減，4周末斑塊內(nèi)仍可見GFP表達，但是較2周前已有減弱。
　　4.4頸動脈斑塊內(nèi)NonO干

35、擾及過表達效果
　　留取頸動脈斑塊組織，檢測斑塊內(nèi)NonO的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示，si-NonO組NonO的mRNA和蛋白水平較Control組分別下降了47％和43％，而NonO組則分別增長了61％和59％，但在si-N.C組和N.C組中NonO的mRNA和蛋白水平與Control組相比無顯著差異。
　　4.5實驗動物一般情況
　　實驗各組ApoE-/-小鼠均順利完成實驗，慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠中未觀察到明顯的局

36、部和全身性的不良反應(yīng)。各組ApoE-/-小鼠的體重?zé)o顯著性差異，血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的濃度亦無發(fā)現(xiàn)顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.6NonO對AS斑塊破裂率的影響
　　通過對連續(xù)組織病理切片的H&E染色分析，我們發(fā)現(xiàn)Control組、si-N.C組和N.C組各有46.67％(7/15)，si-NonO組有13.33％(2/15)，NonO組有66.67％(10/15)的AS斑塊發(fā)生破裂。統(tǒng)計分析顯示，si-No

37、nO組斑塊破裂率顯著低于Control組，而NonO組斑塊破裂率則顯著高于Control組;Control組、si-N.C組和N.C組三組間斑塊破裂率無統(tǒng)計學(xué)差異。含鐵血黃素染色進一步驗證了斑塊破裂。
　　4.7NonO對AS斑塊成分及其易損性的影響
　　與Control組相比，si-NonO組的斑塊內(nèi)巨噬細胞含量、脂質(zhì)含量和易損指數(shù)顯著降低，而平滑肌細胞含量和膠原含量顯著升高;NonO組結(jié)果與si-NonO組相反。Cont

38、rol組、si-N.C組和N.C組間上述指標無顯著差異。
　　4.8NonO對P4Hα1表達的影響
　　體內(nèi)實驗顯示，Control組、si-N.C組和N.C組三組間頸動脈斑塊內(nèi)P4Hα1的蛋白表達無顯著差異。與Control組相比，si-NonO組頸動脈斑塊內(nèi)P4Hα1的蛋白水平顯著增高，而NonO組則顯著降低，說明NonO參與抑制P4Hα1的表達。
　　4.9NonO對基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響
　　在體內(nèi)實驗

39、中，si-NonO組頸動脈斑塊內(nèi)MMP-2和MMP-9的mRNA水平顯著低于Control組;免疫組化和westernblot檢測也證明MMP-2和MMP-9蛋白水平在si-NonO組顯著降低，而NonO組MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白水平較Contro組顯著升高。Control組、si-N.C組和N.C組三組間MMP-2和MMP-9表達水平無顯著差異。體外Westernblot結(jié)果與該結(jié)果一致。同時，我們也檢測了RAW264.7

40、細胞刺激后MMP-2和MMP-9活性的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-NonO組MMP-2和MMP-9活性均顯著降低，而NonO組則顯著升高。
　　4.10NonO對炎癥因子的影響
　　在體內(nèi)實驗中，免疫組化分析顯示si-NonO組的炎癥因子IL-1β和IL-6的蛋白水平較Control組顯著降低，而NonO組則顯著增加IL-1β和IL-6的蛋白表達;westernblot結(jié)果顯示si-NonO組的LOX-1和C

41、OX-2的蛋白表達顯著低于Control組，而NonO組LOX-1和COX-2的蛋白表達則顯著升高。在體外實驗中，Westernblot結(jié)果顯示與Control組相比，si-NonO組IL-1β、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1均顯著降低，而NonO組則顯著升高。
　　4.11NonO與NF-κB的相互作用
　　免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠增加NonO與NF-κB的結(jié)合。細胞免疫熒光染色顯示與Control組相比，

42、si-NonO組NF-κB的核轉(zhuǎn)位顯著降低，而NonO組NF-κB的核轉(zhuǎn)位顯著增強。Westernblot檢測顯示si-NonO組的NF-κB磷酸化水平較Control組顯著降低，而NonO組顯著升高;ⅠκBα的變化趨勢與NF-κB磷酸化水平的變化趨勢相反。
　　5結(jié)論
　　(1)首次發(fā)現(xiàn)NonO在動脈粥樣硬化硬化斑塊中高表達。
　　(2)在ApoE-/-小鼠易損斑塊模型中，NonO降低斑塊穩(wěn)定性，增加斑塊的破裂率，而

43、NonO基因沉默后斑塊穩(wěn)定性增強，破裂率降低。
　　(3)NonO降低斑塊穩(wěn)定性的機制為增加MMP-2和MMP-9的生成，減少P4Hα1的表達以及抑制NF-κB介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)。
　　論文Ⅲ血管緊張素(1-7)對糖尿病腎病的作用及其機制研究
　　1研究背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組易感基因和危險因素共同作用導(dǎo)致的血管疾病。糖尿病(dibetesmellitus，DM)是AS

44、最重要的危險因素之一。鑒于DM在AS中的重要作用，DM已作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的等危癥。DM可引起心肌梗死和腦卒中等大血管疾病，也可引起慢性腎病即糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)和神經(jīng)病變等微血管疾病。多項大規(guī)模的臨床試驗結(jié)果表明，積極控制糖尿病患者的血糖水平有助于減輕微血管病變，但無助于改善大血管病變，提示兩種血管病變的發(fā)生機制可能不同。因此，進一步探討糖尿病微血管病變的發(fā)生機制和干預(yù)靶點具有重要的臨床

45、意義。由于DN是公認的糖尿病微血管病變，因此本文選擇DN作為研究對象。
　　研究發(fā)現(xiàn)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensinsystem，RAS)在DN的發(fā)病過程中起了關(guān)鍵作用，應(yīng)用ACEI/ARB可有效的緩解糖尿病的腎臟損傷，但是并不能達到預(yù)期效果，因此，尋找RAS系統(tǒng)新的干預(yù)靶點以有效緩解DN成為亟待解決的問題。ACE2是ACE的同源物，本實驗室研究發(fā)現(xiàn)ACE2及其產(chǎn)物Ang(1-7)能有效阻止AS的發(fā)生發(fā)展;

46、由于糖尿病是冠心病等危癥，我們因此又應(yīng)用外源性ACE2干預(yù)糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)ACE2也顯著改善了DM心臟功能并減輕了糖尿病腎臟損傷。目前已有大量的證據(jù)證實ACE2能夠延緩DN的發(fā)展，然而，作為ACE2的主要產(chǎn)物，Ang(1-7)在DN中的獨立作用仍不明確。因此，深入研究其在DN中的作用對于認識DN的發(fā)病機制以及DN的治療具有重要意義。
　　Ang(1-7)是一種7肽，是RAS系統(tǒng)中一種重要產(chǎn)物。在腎臟組織內(nèi)，Ang(1-7)主要

47、由ACE2水解AngⅡ生成，在維持腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。AngⅡ可通過多種機制促進DN的發(fā)展，包括升高全身血壓以及腎內(nèi)血流灌注壓，通過激活TGF-β、VEGF、內(nèi)皮素等促進細胞外基質(zhì)的合成以及刺激氧化應(yīng)激等等。而Ang(1-7)是一種舒血管肽，可以對抗AngⅡ的有害作用;同時Ang(1-7)可以減輕NADPH氧化酶(NADPHoxidase，NOX)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激從而減輕蛋白尿并改善血管功能;另外，研究發(fā)現(xiàn)Ang(1-7)還能夠

48、抑制TGF-β的生成。Ang(1-7)的上述效應(yīng)可能會延緩DN的發(fā)展。近期研究還發(fā)現(xiàn)給予糖尿病小鼠重組人類ACE2能夠通過減少NOX活性和PKCα、PKCβ1的生成減輕DN的進展，這種保護作用可能是由AngⅡ水平減低和Ang(1-7)生成增加介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)外源性的Ang(1-7)的應(yīng)用能夠明顯減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的蛋白尿、腎內(nèi)膠原成分并能改善內(nèi)皮功能，其原因可能是Mas受體的激活。然而，ShaoY等卻發(fā)現(xiàn)了與其上完全相反的一個現(xiàn)

49、象:Ang(1-7)明顯加重STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的腎功損傷。
　　如前所述，目前關(guān)于外源性Ang(1-7)對DN作用的研究并不多，而且以上研究還存在以下幾個重要問題亟待解決:1、目前，Ang(1-7)對于DN的確切作用是有益還是有害仍存有爭議;2、不同劑量的Ang(1-7)對DN的具體作用尚未見報道;3、Ang(1-7)與ARB聯(lián)合治療是否優(yōu)于單一治療目前仍不清楚。
　　2研究目的
　　(1)通過STZ注射構(gòu)建DN的

50、大鼠模型，觀察Ang(1-7)對DN的作用，同時探討Ang(1-7)與ARB聯(lián)合應(yīng)用對DN的治療效果。
　　(2)體外實驗中探討Ang(1-7)對DN作用的具體機制，為抗DN治療提供新的思路和藥物作用的新靶點。
　　3方法
　　3.1動物模型
　　120只10周齡的雄性Wistar大鼠隨機分為兩組:Control組(n=15，腹腔注射生理鹽水)和DM組(n=105，腹腔注射STZ溶液，65mg/kg)。STZ注射

51、48小時后，檢測DM組大鼠尾靜脈血糖水平≥16.7mmol/l為造模成功。DM大鼠每3天腹腔注射一次胰島素(2-3U)維持血糖在16.7-25mmol/l以防止高糖誘導(dǎo)的死亡。12周后，DM大鼠隨機分為以下7組（每組15只）:NT組:不接受任何藥物干預(yù);S-Ang(1-7)組:200ng/kg·min的Ang(1-7);M-Ang(1-7)組:400ng/kg·min的Ang(1-7);L-Ang(1-7)組:800ng/kg·min的

52、Ang(1-7);Valsartan組:30mg/kg·d的纈沙坦，灌胃給藥;L+V組:800ng/kg·min的Ang(1-7)+30mg/kg·d的纈沙坦;L+A779組:800ng/kg·min的Ang(1-7)+800ng/kg·min的A779。Ang(1-7)和A779均采用植入式膠囊滲透壓泵皮下包埋持續(xù)泵入的給藥方式。藥物干預(yù)前收集大鼠尿液并頸靜脈穿刺收集空腹靜脈血。藥物干預(yù)4周，收集大鼠24小時尿液及空腹血液。
　

53、　3.2大鼠一般情況檢測
　　實驗結(jié)束后，測量各組大鼠的血糖、收縮壓(SBP)、體重、腎重、24小時尿量、血液和尿液中肌酐含量并計算肌酐清除率。
　　3.3ELISA
　　ELISA檢測血清和尿液中的Ang(1-7)以及尿蛋白水平。
　　3.4SOD和MDA測量
　　分離腎小球，制備腎小球勻漿，檢測腎小球組織SOD及MDA含量。
　　3.5組織病理學(xué)檢測
　　大鼠腎臟組織切片，PAS染色計算腎小

54、球硬化指數(shù)(GSI)。免疫組織化學(xué)染色檢測腎小球內(nèi)Ⅳ型膠原、TGF-β1、VEGF、PCNA和巨噬細胞含量。
　　3.6細胞培養(yǎng)
　　大鼠腎小球系膜細胞系(HBZY-1)分組:Control組:應(yīng)用含5mmol/l葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入20mmol/l的甘露醇以平衡滲透壓;HG組:25mmol/l的葡萄糖刺激24小時;S-Ang(1-7)組、M-Ang(1-7)組和L-Ang(1-7)組:分別應(yīng)用50、100和200nm

55、ol/l的Ang(1-7)預(yù)處理細胞1小時;Valsartan組:10-6mol/l的纈沙坦預(yù)處理細胞1小時;L+V組:200nmol/lAng(1-7)+10-6mol/l纈沙坦預(yù)處理細胞1小時;L+A779組:200nmol/lA779預(yù)處理細胞半小時后加入200nmol/lAng(1-7)處理1小時。所有藥物干預(yù)組細胞在藥物預(yù)處理后應(yīng)用25mmol/l的葡萄糖刺激24小時，收集細胞。
　　3.7Westernblot

56、　　分離并提取腎小球蛋白，westernblot檢測NOX4、p47phox、PKCα、PKCβ1、TGF-β1和p-Smad3的蛋白表達水平。提取大鼠腎小球系膜細胞系HBZY-1的蛋白，westernblot檢測NOX4、p47phox、TGF-β1、p-Smad3、VEGF和Ⅳ型膠原。試劑盒分離并提取HBZY-1細胞的膜蛋白和胞漿蛋白，westernblot分別檢測兩者的PKCα和PKCβ1的蛋白水平。
　　3.8DHE、DC

57、F和EdU熒光染色
　　各組HBZY-1細胞在實驗結(jié)束時應(yīng)用DHE和DCF染色檢測ROS水平。EdU染色檢測細胞增殖水平。
　　4結(jié)果
　　4.1血清和尿液中Ang(1-7)水平
　　Ang(1-7)干預(yù)治療前，DM大鼠各組的血清和尿液Ang(1-7)水平顯著低于Control組。但是Ang(1-7)干預(yù)后，血清和尿液中Ang(1-7)水平呈劑量依賴性升高。另外與NT組相比，纈沙坦組也能升高Ang(1-7)的含量

58、。
　　4.2血壓和血糖檢測
　　DM大鼠的SBP較Control組顯著降低，而DM大鼠各組間無顯著性差異。DM大鼠血糖水平顯著高于對照組，DM大鼠組間無顯著性差異。
　　4.3Ang(1-7)改善腎臟功能
　　與Control組相比，體重和肌酐清除率在NT組顯著降低而腎重/體重、24小時尿量、血清肌酐水平和24小時尿蛋白量在NT組卻顯著升高，提示DN造模成功。Ang(1-7)、纈沙坦以及兩者聯(lián)合治療均能改善上述

59、指標。Ang(1-7)的效應(yīng)呈劑量依賴性，而A779能阻斷Ang(1-7)的上述作用。L-Ang(1-7)組和L+V組腎臟功能改善效果相似并且均優(yōu)于Valsartan組。
　　4.4Ang(1-7)減輕腎小球硬化
　　PAS染色并根據(jù)其陽性面積計算GSI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM各組的GSI均顯著高于Control組。與NT組相比，Ang(1-7)能劑量依賴性的降低GSI，而A779則能夠阻斷該作用。L-Ang(1-7)組與L+V組組

60、間GSI無顯著性差異，但是此兩組的GSI水平均顯著低于Valsartan組。免疫組化顯示NT組腎小球內(nèi)Ⅳ型膠原、TGF-β1、VEGF和PCNA含量均顯著高于Control組。Ang(1-7)、Valsartan以及兩者聯(lián)合治療均能降低上述指標，而且Ang(1-7)的治療效應(yīng)呈劑量依賴性，A779能阻斷其作用。與Valsartan組相比，L-Ang(1-7)和L+V兩組降低上述指標的作用更為明顯，且兩組間無顯著差異。另外，腎小球內(nèi)巨噬細

61、胞浸潤程度在各組間無顯著性差異。
　　4.5Ang(1-7)減少氧化應(yīng)激
　　體內(nèi)實驗中，與Control組相比，NT組的MDA含量顯著增加，而SOD活性則顯著降低。Ang(1-7)、纈沙坦以及兩者聯(lián)合治療均能減少MDA含量而增加SOD活性，其中Ang(1-7)的效應(yīng)呈劑量依賴性，而A779能阻斷該效應(yīng)。L-Ang(1-7)組與L+V組治療效果相似，且均優(yōu)于Valsartan組。
　　在體外實驗中，我們應(yīng)用DHE和DC

62、F染色觀察HBZY-1細胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HG組ROS含量顯著高于Control組，而Ang(1-7)能減少ROS含量，在L-Ang(1-7)組達到最大效應(yīng)。L-Ang(1-7)和L+V兩組間ROS含量無顯著差異，但是均低于Valsartan組。
　　4.6Ang(1-7)減少NOX和PKC的表達
　　提取腎小球蛋白，westernblot檢測顯示NT組NOX4、p47phox、PKCα、PKCβ1顯著高于Contr

63、ol組，而Ang(1-7)劑量依賴性減少上述指標的表達，其大劑量的治療作用與Ang(1-7)聯(lián)合纈沙坦治療作用相似，并且優(yōu)于單純纈沙坦治療，A779治療能阻斷Ang(1-7)的作用。體外實驗中Ang(1-7)對NOX4和p47phox的作用與動物實驗一致。另外，我們分離了HBZY-1細胞膜蛋白和漿蛋白分別檢測PKCα和PKCβ1在其中的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在漿蛋白中PKCα和PKCβ1在各組間無顯著性差異，而在膜蛋白中，PKCα和PKCβ1的

64、變化趨勢與動物實驗結(jié)果一致。
　　4.7Ang(1-7)減少TGFβ1/Smad3和VEGF信號通路以及Ⅳ型膠原的表達
　　體內(nèi)體外實驗均發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，NT組的TGFβ1蛋白表達和Smad3磷酸化水平均顯著升高。Ang(1-7)、Valsartan和兩者聯(lián)合治療均能抑制TGFβ1蛋白表達和Smad3的磷酸化水平，且Ang(1-7)的效應(yīng)呈劑量依賴性，而A779能夠阻斷其作用。L-Ang(1-7)組和L+V兩組

65、的抑制作用強于Valsartan組，而兩組間無顯著性差異。我們又檢測了HBZY-1細胞中VEGF和Ⅳ型膠原的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢與TGFβ1的變化趨勢一致。
　　4.8Ang(1-7)減少腎小球系膜細胞的增殖
　　EdU染色觀察各組細胞間增殖水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比，HG組的EdU陽性細胞百分比顯著升高。Ang(1-7)、Valsartan和兩者聯(lián)合治療均能減少EdU陽性細胞比例，且Ang(1-7)的效應(yīng)呈劑

66、量依賴性，而A779能夠阻斷其作用。L-Ang(1-7)和L+V兩組的抑制作用強于Valsartan組，而兩組間無顯著性差異。
　　5結(jié)論
　　(1)Ang(1-7)劑量依賴性改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病，大劑量Ang(1-7)的腎臟保護作用優(yōu)于纈沙坦治療。兩藥聯(lián)合應(yīng)用未發(fā)現(xiàn)明顯協(xié)同效應(yīng)。
　　(2)Ang(1-7)介導(dǎo)的腎臟保護機制包括Ang(1-7)減輕NOXs和PKCs介導(dǎo)的氧化應(yīng)激并抑制TGFβ1/Smad3和V