Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1在食管鱗癌中生物學(xué)意義的研究.pdf

1、食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的2％，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率排名第八位，死亡率排名第六位。食管癌的病理類型主要包括食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous carcinoma ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma EADC)，同時食管癌還具有區(qū)域性分布的特點，大部分的食管鱗癌主要發(fā)生在亞洲國家。我國就是世界上食管癌發(fā)病率較高的國家之一，全世界每年因食管癌死亡的

2、患者中，約有一半是中國人。在我國的食管癌患者中約90％以上均為食管鱗狀細胞癌。至于食管癌發(fā)生的部位，胸中段食管是食管癌最好發(fā)的部位，其次是胸下段食管，胸上段食管發(fā)生癌癥的幾率相對更少一些。隨著社會科學(xué)的不斷發(fā)展，目前食管癌的治療已經(jīng)發(fā)展成為以外科手術(shù)治療為主，再輔助放、化療等的綜合治療模式。在我國，外科手術(shù)仍然是可切除食管癌首選的治療方法。近年來隨著食管癌診斷技術(shù)的不斷提高，手術(shù)操作技能的不斷改進，術(shù)前新輔助化療的應(yīng)用，再加上術(shù)后規(guī)律放

3、、化療的施行，食管癌患者的生活質(zhì)量在一定程度上逐步得到了改善，但是從整體上而言，食管癌治療的效果仍然不盡如人意，我國食管癌患者術(shù)后的5年總體生存率僅為20％-30％。
　　在解剖學(xué)方面，食管的組織結(jié)構(gòu)與其他消化管道存在有差異，在食管的粘膜固有層和粘膜肌層中存在有著豐富的淋巴管道，因此，即使在T分期較早的食管癌中也可以發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。有資料顯示，在手術(shù)完全切除的食管癌患者中，仍有約27％的患者在手術(shù)后的2-3年之內(nèi)出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移

4、性復(fù)發(fā)。所以，我們除了通過健康查體盡可能做到早期診斷、早期治療并進行積極預(yù)防之外，更深入地研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機制同時尋找更加有效的腫瘤標(biāo)志物對于食管癌的診斷和治療都具有非常重要的意義。
　　食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素的多步驟的非常復(fù)雜的病理過程，近年來，隨著人們對分子生物學(xué)認(rèn)識的不斷深入，大量的研究已經(jīng)證明許多基因的特異性變化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。盡管到目前為止食管癌發(fā)生和發(fā)展的確切

5、機制尚不十分清楚，但是關(guān)于與食管癌相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究一直以來都是食管癌研究領(lǐng)域的一個熱門話題。而且由于食管癌患者的預(yù)后并不理想，因此，尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測食管癌患者預(yù)后的分子生物學(xué)指標(biāo)也是目前迫切需要解決的問題，同時對于指導(dǎo)臨床醫(yī)師為食管癌患者術(shù)后選擇針對性的輔助治療也具有非常重要的意義。
　?、裥湍z原蛋白(collagen type Ⅰ)是膠原蛋白(collagen)的一種，是人體組織中分布最為廣泛的膠原蛋白，它是細胞外基

6、質(zhì)的主要成分，是一種結(jié)構(gòu)蛋白，其主要的功能是起到連接和支持組織細胞的作用，對于人體本身的作用是比較溫和的。但是Ⅰ型膠原蛋白的高表達與許多的纖維化疾病的發(fā)生是密切相關(guān)的，而目前的許多研究也發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白在多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、腦腫瘤等中也呈高表達。并且有資料顯示，Ⅰ型膠原蛋白在鱗癌中的表達要比在腺癌中的表達更具有活性。因此，Ⅰ型膠原蛋白可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中扮演一個非常重要的角色。
　　轉(zhuǎn)化生長因子β1（Tra

7、nsforming growth factor-β1，TGF-β1）是TGF超家族中的一個成員，它與腫瘤之間關(guān)系的研究一直以來都是人們研究的焦點。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1也在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，如結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌、腎癌、淋巴瘤等，而且其可能在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。有資料顯示，TGF-β1對于腫瘤的作用機制不僅僅具有復(fù)雜性，而且還具有矛盾性，在腫瘤發(fā)生的早期它可以抑制細胞的增殖、啟動細胞的分化、誘導(dǎo)細胞凋亡;但是當(dāng)細

8、胞發(fā)生惡變時，TGF-β1又可以起到促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。同時也有研究證實，TGF-β1還具有強有力的刺激Ⅰ型膠原蛋白合成的作用。
　　到目前為止，有關(guān)Ⅰ型膠原蛋白是否在食管鱗癌細胞中呈高表達，其與食管鱗癌各臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系如何，在食管鱗癌中Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1的表達之間是否也具有相關(guān)性，國內(nèi)外幾乎沒有相關(guān)的報道。而關(guān)于TGF-β1與食管鱗癌之間關(guān)系雖然已經(jīng)有一些研究，但是研究的結(jié)果卻不盡相同，有的結(jié)果甚至

9、完全相反，究竟哪些結(jié)果更準(zhǔn)確，我們目前尚無法判斷，但是如果我們要進行更深一步的研究，而由于前人的研究并不能給予我們確切的結(jié)果進行指導(dǎo)，所以，我們就必須以自己的實驗結(jié)果作為研究的基礎(chǔ)，這也是我們再次選擇TGF-β1作為研究對象的原因之一。
　　本課題通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)、western免疫印跡、實時定量-聚合酶聯(lián)反應(yīng)的實驗方法分別從蛋白和基因的不同角度研究了Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1在食管鱗癌組織中的表達以及二者的相關(guān)性，并探討了Ⅰ

10、型膠原蛋白和TGF-β1與食管鱗癌各臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。旨在為探索食管癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找特異的預(yù)后指標(biāo)以及為食管癌的治療尋找理想靶點提供有力的理論依據(jù)，同時我們也希望能夠為人類在戰(zhàn)勝惡性腫瘤的道路上貢獻自己的一點微薄之力。
　　第一部分:Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1在食管鱗癌中的表達及與生物學(xué)特性的關(guān)系
　　目的:食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個由多因素參與的多步驟的復(fù)雜的病理過程，本文旨在研究Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β

11、1在食管鱗癌組織中的表達以及與食管鱗癌各臨床病理特征之間的關(guān)系，以探討其在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能的作用。
　　方法:本實驗收集了2010年3月-2011年1月期間在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科施行食管癌完全切除的82例食管鱗癌患者的標(biāo)本，其中包括82例食管鱗癌組織及隨機選取的20例癌旁正常食管粘膜組織。采用免疫組化和Western-blot的方法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管粘膜組織中Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1的表達情況，采

12、用實時熒光定量PCR方法檢測食管鱗癌組織和癌旁正常食管粘膜組織中Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1mRNA的表達情況。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，將患者的臨床資料、病理學(xué)特征及實驗結(jié)果共同建立數(shù)據(jù)庫，計數(shù)資料采用x2檢驗或Fisher's精確概率檢驗;計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較時采用獨立樣本t檢驗（方差齊時）或t'檢驗（方差不齊時）;多組計量資料均數(shù)之間的比較采用方差分析（F檢驗），如果差別有統(tǒng)計學(xué)意義，

13、則行SNK檢驗法進行組間兩兩比較，Ⅰ型膠原蛋白與TGF-β1表達水平的相關(guān)性采用Sperman或Person法進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原蛋白的陽性表達表現(xiàn)為在細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒，食管鱗癌組織中Ⅰ型膠原蛋白表達明顯高于癌旁正常食管粘膜組織(P=0.000)，Ⅰ型膠原蛋白的表達與腫瘤的浸潤深度(pT)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期相關(guān)(P=0.030，P=0.044，P

14、=0.034)，隨著腫瘤浸潤深度的增加和pTNM分期的增高，Ⅰ型膠原蛋白的表達呈增高趨勢，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織的Ⅰ型膠原蛋白的表達要明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織;TGF-β1蛋白的陽性表達表現(xiàn)為在細胞漿內(nèi)或者細胞膜上出現(xiàn)棕黃色的顆粒，食管鱗癌組織TGF-β1蛋白表達也明顯高于癌旁正常食管粘膜組織(P=0.008)，TGF-β1蛋白的表達與腫瘤的浸潤深度(pT)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期相關(guān)(P=0.014，P=0.033，P

15、=0.017)，隨著腫瘤浸潤深度的增加和pTNM分期的增高，TGF-β1蛋白的表達明顯增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織的TGF-β1蛋白的表達要明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織;并且Ⅰ型膠原蛋白與TGF-β1在食管鱗癌中的表達水平呈顯著相關(guān)(r=0.743，P=0.000)。Western-blot結(jié)果顯示食管鱗癌組織中Ⅰ型膠原蛋白表達水平顯著高于癌旁正常食管粘膜組織(P=0.000)，Ⅰ型膠原蛋白表達水平與腫瘤浸潤深度(pT)和pT

16、NM分期相關(guān)（P=0.000，P=0.000），隨著腫瘤浸潤深度的增加和pTNM分期的增高，Ⅰ型膠原蛋白表達水平逐漸增高，經(jīng)過SNK檢驗進行組間比較，不同腫瘤浸潤深度(pT)各組之間均有顯著差異(P＜0.05)，TNM分期各組之間進行比較，pⅠ期組與pⅡ期組和pⅢ期組間存在顯著差異(P＜0.05)，而pⅡ期組和pⅢ期組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;TGF-β1蛋白在食管鱗癌組織中表達水平要顯著高于癌旁正常食管粘膜組織(P=0.

17、000)，TGF-β1蛋白表達水平與腫瘤浸潤深度(pT)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期相關(guān)(P=0.000，P=0.043，P=0.000)，隨著腫瘤浸潤深度的增加和pTNM分期的增高，TGF-β1蛋白表達水平逐漸增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織的TGF-β1蛋白表達水平要明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織，經(jīng)過SNK檢驗進行組間比較，不同腫瘤浸潤深度(pT)各組之間均有顯著差異(P＜0.05)，而TNM分期各組之間進行比較，pⅠ期組與pⅡ

18、期組和pⅢ期組間存在顯著差異(P＜0.05)，pⅡ期組和pⅢ期組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);并且經(jīng)Person法檢驗Ⅰ型膠原蛋白與TGF-β1蛋白在食管鱗癌組織中的表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.765，P=0.000)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:食管鱗癌組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對表達量要明顯高于癌旁正常食管組織（P=0.000），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織的Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對表達量要顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗

19、癌組織(P=0.030，P=0.001);隨著腫瘤浸潤深度的加深、TNM分期的增高Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達呈顯著增高(P=0.000，P=0.000)，經(jīng)過SNK檢驗進行組間比較，不同腫瘤浸潤深度(pT)各組之間均有顯著差異(P＜0.05)，TNM分期各組之間進行比較，pⅠ期組與pⅡ期組和pⅢ期組間存在顯著差異(P＜0.05)，而pⅡ期組和pⅢ期組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;食管鱗癌組織中TGF-β1mRNA相對表達量要明

20、顯高于癌旁正常食管組織（P=0.000，P=0.000），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織的TGF-β1mRNA的相對表達量要顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織(P=0.001);隨著腫瘤浸潤深度的加深、TNM分期的增高TGF-β1mRNA的表達呈顯著增高(P=0.000，P=0.000)，經(jīng)過SNK檢驗進行組間比較，結(jié)果顯示各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;而且Ⅰ型膠原蛋白mRNA和TGF-β1mRNA在食管鱗癌中的表達水平呈顯著

21、正相關(guān)(r=0.636，P=0.000)。
　　結(jié)論:食管鱗癌組織中存在著Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1的高表達，而且兩者的表達呈正相關(guān)。食管鱗癌組織中的Ⅰ型膠原蛋和TGF-β1的表達均與腫瘤的浸潤深度(pT)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期顯著相關(guān)，提示Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。
　　第二部分:Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1與食管鱗癌預(yù)后關(guān)系的研究
　　目的:食管鱗癌具有

22、發(fā)病率高、死亡率高和預(yù)后差的特點，本實驗主要探討Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1與食管鱗癌預(yù)后關(guān)系，旨在尋找能夠更準(zhǔn)確預(yù)測食管癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。
　　方法:本實驗收集了2010年3月-2011年1月期間在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科施行食管癌完全切除的82例食管鱗癌患者的標(biāo)本。采用免疫組化方法檢測食管鱗癌組織中Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1的表達情況，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，將患者的臨床、病理學(xué)特征及IHC實驗

23、結(jié)果共同建立數(shù)據(jù)庫，采用Kaplan-Meier法計算生存率，Log-rank檢驗比較生存率的差異，應(yīng)用Cox回歸分析判定影響食管鱗癌術(shù)后生存率的獨立危險因素。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:所有患者術(shù)后均進行隨訪，平均隨訪時間為22.5個月（8-36個月），本組82例食管鱗癌患者術(shù)后總體3年生存率是53.7％。Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果顯示:腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β

24、1都是影響食管鱗癌患者術(shù)后3年生存率的相關(guān)因素。不同腫瘤的浸潤深度(pT)的食管鱗癌患者的3年生存率分別為pT1組:100％，pT2組:53.3％，pT3組:39.3％，各組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性的食管鱗癌患者的3年生存率分別為:67.3％和25.9％，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);不同pTNM分期的食管鱗癌患者的3年生存率分別為pⅠ組:100％，pⅡ組:52.5％，pⅢ組:28.6％

25、，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);TGF-β1蛋白表達陽性和陰性的食管鱗癌患者的生存率分別為41.7％和86.4％，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;Ⅰ型膠原蛋白表達陽性和陰性的食管鱗癌患者的生存率分別為45.3％和83.3％，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Cox回歸分析顯示:只有腫瘤浸潤深度(pT)(P=0.047)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.007）是影響食管鱗癌患者術(shù)后3年生存率的獨立危險因素。
　

26、　結(jié)論:腫瘤的浸潤深度(pT)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、Ⅰ型膠原蛋白和TGF-β1與食管鱗癌患者預(yù)后相關(guān)。但是只有腫瘤浸潤深度(pT)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管鱗癌患者預(yù)后的獨立危險因素。
　　第三部分:TGF-β1對Eca109細胞合成Ⅰ型膠原蛋白影響的研究
　　目的:TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白在食管鱗癌細胞中的表達具有相關(guān)性，本文旨在探討通過TGF-β1作用于體外培養(yǎng)的食管癌Eca109細胞，是否會能夠影響Ⅰ型膠原蛋白的合成，

27、并進一步探討TGF-β1影響食管鱗癌細胞合成Ⅰ型膠原蛋白的作用機制。
　　方法:體外培養(yǎng)食管癌Eca109細胞，用5ng/ml的TGF-β1分別作用于培養(yǎng)細胞0h、12h、24h、48h后收集細胞，用不同濃度0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml的TGF-β1作用Eca109細胞48h，采用qRT-PCR和Western-blot方法檢測TGF-β1作用后的Eca109細胞中Ⅰ型膠原蛋白的表達情況，結(jié)果進行半定量

28、。用設(shè)計好的Smad4 siRNA序列，應(yīng)用lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，沉默Eca109細胞系的Smad4基因，再用TGF-β1作用Eca109細胞，采用Western-blot方法檢測Eca109細胞中Ⅰ型膠原蛋白的表達情況，SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果顯示:TGF-β1作用0h、12h、24h、48h的Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白mRN

29、A相對表達量之間存在顯著差異(P＜0.05)。組間兩兩比較顯示，TGF-β1作用12h、24h和48h的Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達量要明顯高于作用0h（P＜0.05），作用24h和48h的Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達量明顯高于作用12h(P＜0.05)，而作用24h和48h兩組的Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達量無明顯差異（P＞0.05）。不同濃度的TGF-β1作用Eca109細胞48h的Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對表達量之間存在顯

30、著差異(P＜0.05)，隨著TGF-β1濃度的升高Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達量也逐漸增加。Western-blot結(jié)果顯示，TGF-β1分別作用0h、12h、24h、48h的Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白相對表達量之間也存在顯著差異(P＜0.05)。組間兩兩比較，TGF-β1作用12h、24h和48h的Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達量要明顯高于作用0h(P＜0.05)，作用24h和48h的Ⅰ型膠原蛋白的表達量明顯高于作用12h(P＜0

31、.05)，而作用24h和48h兩組的Ⅰ型膠原蛋白的表達量無明顯差異(P＞0.05)。不同濃度的TGF-β1作用Eca109細胞的Ⅰ型膠原蛋白的相對表達量之間存在顯著差異（P＜0.05），隨著TGF-β1濃度的升高Ⅰ型膠原蛋白的表達量也同步增加。沉默Smad4基因后Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達明顯減少，而沉默Smad4基因后再加入TGF-β1處理因素，TGF-β1上調(diào)Eca109細胞Ⅰ型膠原蛋白表達的作用則消失。
　　結(jié)論:T