RET和TrkB在神經(jīng)元膜表面分布水平不同以及神經(jīng)元活性依賴的RET膜表面插入的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 RET酪氨酸激酶受體在神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟等器官的發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，RET受體主要表達(dá)于中腦、交感神經(jīng)節(jié)和感覺神經(jīng)節(jié)，例如在成年大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion,DRG)，大約一半的神經(jīng)元中表達(dá)RET受體，這類神經(jīng)元也被稱為非肽能感受器。RET受體在這類神經(jīng)元的生長發(fā)育和維持過程中具有至關(guān)重要的作用。RET的配體為一類膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-d

2、erivedneurotrophicfactor，GDNF)家族配體(GDNFfamilyligands，GFLs)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GFL家族成員包括GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)，分別與四種膜錨定蛋白共受體GFRα1-4形成GFL/GFRα復(fù)合物進(jìn)而與細(xì)胞膜表面的RET結(jié)合激活其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?；罨腞ET受體通過激活下游信號通路包括RAS/MAPK和PI3K/Akt

3、等來促進(jìn)細(xì)胞的存活、遷移和突起生長等。非肽能感受器神經(jīng)元中同時也表達(dá)另外一種神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkB(tropomyosin-relatedkinaseB)，該受體也己被證明在多種神經(jīng)元中具有促進(jìn)生長發(fā)育和維持存活的功能。近期有報道表明在非肽能感受器神經(jīng)元中RET主要功能是促進(jìn)神經(jīng)元的突起生長，而TrkB則負(fù)責(zé)維持其存活。這提示我們兩種受體在此類神經(jīng)元中的某些差異可能導(dǎo)致他們發(fā)揮不同的功能。
　　 受體在細(xì)胞膜表面正常分布是其行

4、使功能的關(guān)鍵步驟之一，已有許多報道表明可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面受體的含量來控制細(xì)胞對特定胞外信號的反應(yīng)強(qiáng)度。雖然GFL誘導(dǎo)的RET信號通路已經(jīng)研究的比較清楚，但目前關(guān)于RET受體的膜表面分布的分布調(diào)控尚無報道。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的氨基酸序列或者位點在精確調(diào)控受體向細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中發(fā)揮著重要作用，而且在這一過程中，也常會有一些胞內(nèi)蛋白激酶參與。然而，是否存在類似機(jī)制可以調(diào)控RET的膜表面分布尚無報道。
　　 因此，我們

5、的研究旨在探明RET受體膜表面分布是否受到調(diào)控并探究其調(diào)控的具體機(jī)理，為更為深入的闡明GFL/RET信號通路的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 1.對比RET和TrkB受體在DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的分布水平是否存在差異，并尋找決定其分布水平的關(guān)鍵氨基酸序列。
　　 2.尋找在RET膜表面分布調(diào)控過程中發(fā)揮作用的胞內(nèi)蛋白激酶。
　　 3.檢測神經(jīng)元活性是否可以調(diào)控RET的膜表面分布。
　

6、　 4.通過改變RET膜表面水平，觀察是否影響配體誘導(dǎo)的RET信號和功能。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1.DRG神經(jīng)元細(xì)胞膜表面RET與TrkB受體分布水平的比較
　　 我們首先利用免疫組織化學(xué)染色的方法確定了RET和TrkB受體在新生7天大鼠的DRG神經(jīng)元中存在共表達(dá)。然后將DRG神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用膜表面蛋白生物素化的方法收集膜表面蛋白，通過westernblot檢測膜表面的RET、TrkB含量，并與免

7、疫沉淀方法得到的相應(yīng)的受體表達(dá)總量對比得到受體膜表面分布的相對比率。通過此方法我們發(fā)現(xiàn)二者的膜表面分布水平存在顯著差異，RET的膜表面水平大約為TrkB的1.5倍。
　　 2.RET與TrkB的胞內(nèi)域決定了它們具有不同的膜表面含量
　　 接下來我們利用構(gòu)建嵌合蛋白受體的方法在PC12細(xì)胞中檢測了RET與TrkB膜表面分布水平差異的自身結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。我們構(gòu)建了互換胞外域的嵌合受體(RETTrkBIC和TrkBRETIC)并體外

8、轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的PC12細(xì)胞。利用膜表面生物素化的方法收集膜表面蛋白，通過westernblot定量分析嵌合受體的膜表面分布水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胞外域相同的情況下(RET和RETTrkBIC、TrkB和TrkBRETIC)，不同的RET和TrkB胞內(nèi)域仍然導(dǎo)致了不同的膜表面分布水平，證明了是胞內(nèi)域結(jié)構(gòu)決定了RET和TrkB的膜表面水平差異。
　　 3.受體細(xì)胞膜表面分布水平免疫熒光定量分析方法的建立
　　 為了更為直觀地反映受體

9、膜表面含量和總表達(dá)量的比率，我們引入了以前工作中采用的受體細(xì)胞膜表面分布水平免疫熒光定量分析方法。構(gòu)建了N-端帶有Flag標(biāo)簽和C-端融合了綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)的嵌合受體，將這種嵌合受體轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，在非透化條件下以Flag抗體做免疫熒光染色時，膜表面染色的紅色熒光可代表膜表面的受體的含量，綠色GFP熒光則可代表總的受體表達(dá)量，這樣便可以直觀的觀察到受體的的膜表面分布水平并可以利

10、用紅色/綠色熒光的比值來相對地比較各受體之間膜表面分布水平的差異。我們利用生物素化的方法證明了Flag標(biāo)簽和融合了GFP蛋白的引入不影響受體的膜表面分布。以此嵌合受體為基礎(chǔ)，應(yīng)用免疫熒光定量分析方法得到的結(jié)果也與生物素化方法得到的結(jié)果基本一致，所以我們在此后的研究中主要采用了免疫熒光定量分析方法來定量比較不同嵌合受體的膜表面分布水平。
　　 4.RET的近膜區(qū)的Boxl模序決定了RET在細(xì)胞膜表面具有與TrkB不同的分布水平

11、r>　　 在已知胞內(nèi)域決定RET與TrkB受體不同膜表面分布水平的基礎(chǔ)上，我們將兩種受體的胞內(nèi)相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了相互轉(zhuǎn)換，外源轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，利用免疫熒光定量分析方法對比結(jié)構(gòu)域互換對受體膜表面水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)近膜區(qū)(Juxtamembraneregion,JM)的互換導(dǎo)致RET膜表面含量顯著下降而TrkB的含量則顯著上升，證明了JM區(qū)是二者具有不同膜表面分布水平的充分必要結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)一步確定具體的調(diào)控序列，我們依據(jù)RET和T

12、rkBJM區(qū)序列的同源性比對結(jié)果把該區(qū)域細(xì)分為三個BOX域進(jìn)行序列互換。發(fā)現(xiàn)RETBox1模序置換入TrkB可將其膜表面水平提高約1.5倍，而TrkBBoxl模序置換入RET則將其膜表面水平下調(diào)至對照組的約0.6倍。這一關(guān)鍵結(jié)果也利用生物素化的方法得到了重復(fù)驗證。
　　 將Boxl模序置換的RET和TrkB嵌合受體轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元也得到了相似結(jié)果，證明Boxl模序區(qū)域決定了RET在細(xì)胞膜表面的分布水平高于TrkB。

13、>　　 5.PKC活性可以促進(jìn)RET的膜表面分布
　　 對RET的Boxl區(qū)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)其Thr675殘基可能是一個潛在的蛋白激酶C的磷酸化位點。我們初步先利用加入抑制劑或者激動劑的方法證明了PKC可以促進(jìn)RET的膜表面分布，同時將Thr675突變?yōu)锳la(T675A)使其不能被磷酸化則阻斷了PKC的作用，而突變?yōu)锳sp(T675D)模擬Thr的持續(xù)磷酸化可提升RET的膜表面含量。這證明了PKC對RET膜表面分布的調(diào)控作用并

14、間接地說明了這種作用可能是通過磷酸化Thr675位點實現(xiàn)的。
　　 6.神經(jīng)元去極化通過激活PKC增強(qiáng)RET受體的膜表面插入
　　 結(jié)合已有許多報道顯示神經(jīng)元活性通過激活胞內(nèi)蛋白激酶如PKC等來調(diào)控受體的膜表面插入，我們應(yīng)用高K+作用去極化結(jié)合蛋白激酶抑制劑的方法研究活性對RET膜表面分布的影響及其與蛋白激酶的聯(lián)系。50mMKCl作用可以顯著增強(qiáng)RET的膜表面分布，而這一作用可以被PKC抑制劑和T675A突變所阻斷，證明

15、去極化通過激活PKC可以增強(qiáng)RET的膜表面插入。
　　 7.Thr675位點磷酸化介導(dǎo)了PKC和去極化對RET膜表面分布的調(diào)控
　　 為證明PKC和去極化對RET膜表面分布的調(diào)控通過磷酸化Thr675位點實現(xiàn)，我們制作了特異性識別磷酸化Thr675位點的抗體。在PKC激動劑和去極化作用下，Thr675的磷酸化水平顯著升高。相對于胞內(nèi)的RET，膜表面的RET具有更為顯著的磷酸化傾向。這部分結(jié)果證明了Thr675位點磷酸化介

16、導(dǎo)了PKC和去極化對RET膜表面分布的調(diào)控。
　　 8.Thr675位點可調(diào)控RET對GDNF刺激的反應(yīng)強(qiáng)度
　　 受體膜表面分布水平的調(diào)控可以改變細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)性。在已知Thr675影響RET膜表面分布水平的條件下，我們觀察了突變Thr675位點對RET介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及功能的影響。在外源轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞中，T675A突變降低了GDNF刺激時RET受體的激活水平，下游信號分子Erk1/2和Akt磷酸化水平也顯著降