NaHCO3脅迫下二色補(bǔ)血草基因的表達(dá)研究及VHA-c基因的功能驗(yàn)證.pdf

1、二色補(bǔ)血草是一種鹽生開(kāi)花植物，能夠在鹽堿化土地上正常生長(zhǎng)，其優(yōu)良的耐鹽堿特性使之成為研究植物耐鹽機(jī)理的理想材料。本研究結(jié)合表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)和cDNA微陣列技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上研究二色補(bǔ)血草耐鹽堿機(jī)理，并對(duì)從文庫(kù)中獲得的液泡膜H+-ATPase c亞基基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析及功能驗(yàn)證。
　　以400 mmol/L NaHCO3脅迫處理48h的二色補(bǔ)血草葉片為材料構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，文庫(kù)的初始滴度為9.6×105

2、 pfu/ml，文庫(kù)的重組率為95％，PCR檢測(cè)插入片段的平均長(zhǎng)度為0.9 kb。從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選2880個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定，共篩選到2358個(gè)高質(zhì)量的EST序列，建立了二色補(bǔ)血草EST數(shù)據(jù)庫(kù)，它們GenBank的登錄號(hào)為EH792855-EH795212;通過(guò)BlastX分析，共有1418條序列與已知基因序列高度同源，將這些EST序列根據(jù)MIPS分類標(biāo)準(zhǔn)分為12類，其中代謝、光合作用、功能未知、細(xì)胞防御及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)四類基因的表達(dá)

3、豐度最高，分別占已分類EST總數(shù)的18.48％、14.6％、11.99％、11％和10.01％。EST分析表明，有245個(gè)EST是與早期逆境響應(yīng)同源的基因，其中最顯著的是金屬硫蛋白(EH793637)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EH794695)，它們各自都占總EST的1.4％。選擇1330條EST制作cDNA微陣列，獲得了NaHCO3脅迫6h、24h和48h的二色補(bǔ)血草的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，篩選到142條差異調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本，6、24和48h分別有108、4

4、3和46個(gè)基因出現(xiàn)明顯的差異表達(dá)?；蛐酒芯拷Y(jié)果表明，有76％的基因確定是在脅迫早期(脅迫6h)差異表達(dá)，因此認(rèn)為二色補(bǔ)血草在鹽堿脅迫初始階段的響應(yīng)是重要的。
　　對(duì)從二色補(bǔ)血草cDNA文庫(kù)中獲得的液泡膜H+-ATPase c亞基（VHA-c）基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，VHA-c基因cDNA全長(zhǎng)729bp，其中開(kāi)放讀碼框(ORF)為498bp，編碼165個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為16.6kD，理論等電點(diǎn)為8.62。利用實(shí)時(shí)熒光

5、定量RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因在二色補(bǔ)血草中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，NaCl誘導(dǎo)了VHA-c基因在二色補(bǔ)血草葉部的表達(dá)，抑制其在根部的表達(dá);NaHCO3脅迫下，VHA-c基因分別于12h和6h時(shí)在葉部及根部表達(dá)量最高; Na2CO3脅迫6h時(shí)VHA-c基因在根部的表達(dá)量最大，48h在葉部大量表達(dá)。說(shuō)明VHA-c基因能夠?qū)}脅迫做出應(yīng)答，確定該基因?yàn)槟望}相關(guān)基因。
　　將該基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pROKⅡ上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)

6、現(xiàn)VHA-c基因?qū)δＪ街参餆煵莸霓D(zhuǎn)化，通過(guò)耐鹽性試驗(yàn)，對(duì)VHA-c基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因煙草的SOD和POD活性較非轉(zhuǎn)基因煙草顯著增加，MDA含量低于非轉(zhuǎn)基因煙草，說(shuō)明VHA-c基因的表達(dá)增強(qiáng)了植物清除活性氧的能力，并降低了植物的膜脂氧化程度，一定程度的提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽能力，證實(shí)了來(lái)源于二色補(bǔ)血草的VHA-c基因具有提高植物耐受鹽脅迫之能力的功能。
　　植物的耐鹽過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的多基因協(xié)同作用的體系