可逆光開關(guān)熒光蛋白的開發(fā)及其在超高分辨率顯微成像中的應(yīng)用.pdf

1、近年來超高分辨率顯微成像技術(shù)成為生物領(lǐng)域研究中不可或缺的工具，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展。同時(shí)，人們對(duì)優(yōu)良探針的渴望日益迫切?？赡婀忾_關(guān)熒光蛋白(reversibly switchablefluorescent proteins，RSFPs)是一類在特定光照下能夠進(jìn)行亮-暗狀態(tài)可逆轉(zhuǎn)變的熒光分子探針，它們?cè)诨罴?xì)胞超高分辨率成像技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用。然而，現(xiàn)如今可逆光開關(guān)熒光蛋白的品種單一，性能需要優(yōu)化。因此，我們選擇性質(zhì)較好、使用廣泛

2、的光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mEos3.1為模板，在其His62位進(jìn)行飽和定點(diǎn)突變，獲得了一系列具有高亮度，高穩(wěn)定性和高信噪比等不同優(yōu)良性質(zhì)的新型熒光蛋白，它們和Dronpa一樣能夠被488 nm光照射轉(zhuǎn)化為暗態(tài)，405 nm光激發(fā)至亮態(tài)且反復(fù)多次循環(huán)。我們把這類新型的綠色單體光開關(guān)熒光蛋白命名為Skylan(skylantern)家族。
　　在超高分辨率光學(xué)波動(dòng)成像（super-resolution optical fluctuation

3、imaging，SOFI）中，新型熒光蛋白Skylan-S展示了很高的光穩(wěn)定性，對(duì)比度和波動(dòng)狀態(tài)的平均熒光值，比現(xiàn)有適用于SOFI成像探針Dronpa的圖片像素?zé)晒獠▌?dòng)范圍提高了四倍，從而獲得了更高的SOFI分辨率。基于這些特性，我們使用Skylan-S標(biāo)記網(wǎng)格蛋白應(yīng)用于SOFI成像獲得了高于100 nm的空間分辨率，成功解析出成熟的網(wǎng)格蛋白包被小泡(CCPs)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而且在1.5 s的超高時(shí)間分辨率下長(zhǎng)時(shí)程拍攝持續(xù)60 s連續(xù)重構(gòu)出

4、40張CCPs的動(dòng)態(tài)SOFI圖像。這些結(jié)果說明Skylan-S適合用于長(zhǎng)時(shí)程、超高時(shí)間-空間分辨率的SOFI成像技術(shù)。
　　活細(xì)胞條紋模式光激活非線性結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(PA NL-SIM)中，新型熒光蛋白Skylan-NS具有很高的對(duì)比度，在“亮”狀態(tài)擁有較高的亮度和光穩(wěn)定性，能夠在100 w/cm2極低的光照強(qiáng)度下進(jìn)行活細(xì)胞超高分辨率成像，獲得了高達(dá)60 nm的分辨率，且在亞秒級(jí)時(shí)間內(nèi)大視野持續(xù)采集十多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)，Skyl

5、an-NS與Dronpa和rsEGFP2相比，標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白能夠得到更精細(xì)，信噪比更高的結(jié)構(gòu)圖像。這些優(yōu)良特性使得Skylan-NS適合應(yīng)用于多種活細(xì)胞超高分辨率成像系統(tǒng)，從而獲得更高的分辨率。超高分辨率成像技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用使得我們能夠?qū)ι锓肿舆M(jìn)行精確定位。在成功發(fā)展了一些優(yōu)秀的熒光探針用于超高分辨率成像之后，我們開始用來解決生物學(xué)問題。已知的凋亡體是在細(xì)胞凋亡早期用來激活胱天蛋白酶caspase起始物的多蛋白復(fù)合體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中

6、凋亡體的裝配包括細(xì)胞凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1與細(xì)胞色素c及ATP/dATP結(jié)合后激活胱天蛋白酶caspase-9，但是昆蟲的凋亡體裝配途徑至今仍不清楚。因此我們使用Skylan家族以及多種熒光蛋白探針分別標(biāo)記鱗翅目昆蟲凋亡體的各組分蛋白，為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)體系，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)并進(jìn)行多色3D-SIM成像，展示了在細(xì)胞凋亡初期，鱗翅目細(xì)胞色素c從線粒體中釋放出來與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合進(jìn)而形成凋亡體過程中的多蛋白定位及結(jié)構(gòu)變化。我們首