構巢曲霉磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)家族的生物學功能研究及其對酶活力的協(xié)同調(diào)控作用.pdf

1、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)在體內(nèi)催化五磷酸核酮糖(R-5-P)和三磷酸腺苷(ATP)合成磷酸核糖焦磷酸（PRPP）。其產(chǎn)物PRPP參與體內(nèi)的多種代謝途徑，例如磷酸戊糖途徑，嘌呤和嘧啶核苷酸的從頭合成和補救途徑以及組氨酸和色氨酸的合成。在人體中，PRS基因的多種突變形式與人的許多神經(jīng)性疾病相關，但是其致病機理尚不清楚。由于構巢曲霉是多細胞真核生物，在同緣關系上較單細胞的酵母與人類的同源關系更為接近，且具有結構簡單、遺傳背景清楚、遺傳可

2、操作性強等特征，因此常被用來作為研究與人類疾病相關基因功能的重要模式生物。本研究以構巢曲霉為模式生物研究PRS蛋白家族在細胞發(fā)育過程中的功能。
　　已有研究表明釀酒酵母中的PRS蛋白家族在釀酒酵母中存在5個同源蛋白，且以形成兩個功能互補的復合體的形式發(fā)揮作用，通過同源比對(BLAST)，我們發(fā)現(xiàn)在構巢曲霉中存在三個PRS蛋白的同源蛋白。根據(jù)它們與釀酒酵母PRS1-5蛋白的同源關系，我們將其命名為AnPRS1，AnPRS2和AnPR

3、S3。其中AnPRS2這個蛋白與人類疾病相關蛋白PRPS1(HomoSapiens)的同—性(idendity)高達66.7％，且包含所有與疾病相關的突變位點。
　　在我們實驗室前期篩選構巢曲霉控制胞質(zhì)分裂的SIN途徑(SeptationInitiation Network)的反向調(diào)節(jié)子的研究中也發(fā)現(xiàn)，構巢曲霉中PRS酶活力的降低可以抑制SIN途徑下游關鍵激酶SEPH的缺失表型。
　　我們對編碼這三個蛋白的基因分別進行敲除和

4、啟動子替換實驗，發(fā)現(xiàn)Anprs1的敲除或抑制表達對菌絲的生長發(fā)育影響不大，但是對Anprs2或Anprs3的敲除或抑制表達均會導致構巢曲霉孢子不能萌發(fā)，表現(xiàn)出致死基因的表型。此外，在構巢曲霉的不同生長階段關閉Anprs1，2，3發(fā)現(xiàn)，ANPRS2在菌絲的整個生長階段都是必需的，而Anprs1和Anprs3在菌絲生長階段的關閉都不會對菌株發(fā)育產(chǎn)生影響。我們通過條件啟動子高表達Anprs1，2,3發(fā)現(xiàn)，高表達Anprs2會導致胞質(zhì)分裂的失敗

5、以及產(chǎn)孢不能發(fā)生，高表達Anprs3和Anprs1均會導致產(chǎn)孢和胞質(zhì)分裂的一定缺陷。
　　為了進一步弄清楚AnPRS1，2，3三個蛋白的細胞學功能，我們分別測定了抑制三個蛋白表達情況下的PRS酶活，發(fā)現(xiàn)這三個蛋白對酶活的貢獻是不同的，在抑制ANPRS2表達的情況下，PRS總酶活只有野生型的5％，而抑制ANPRS3表達，其PRS總酶活是野生型的25％，抑制ANPRS1表達可使酶活維持在野生型的80％。實時定量PCR(Real-tim

6、e-qPCR)結果顯示Anprs1，2,3這三個基因的表達水平在菌絲的生長階段也不同，以Anprs2的表達水平最高，Anprs3次之，Anprs1最少。這些結果都建議Anprs2在構巢曲霉的生長發(fā)育過程中扮演著最為重要的角色。
　　綜上所述，AnPRS2作為人類疾病相關蛋白HumanPRPS1的同源蛋白，在構巢曲霉的生長發(fā)育過程中同樣發(fā)揮著重要作用，對其抑制和高表達情況下的細胞學表型分析，將有助于我們理解因為人類PRPS1突變而造