暨南大學(xué)高級生理學(xué)研究生課程講義離子通道20091030

1、離子通道(ion channel),第一節(jié) 離子通道概述 一、離子通道的分類 二、離子通道的結(jié)構(gòu) 三、離子通道的特點(diǎn) 四、通道的激活 五、影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率的因素 六、通道轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn) 七、 K＋、Na+、Ca2+、 Cl-通道第二節(jié) 離子通道研究方法與技術(shù) 一、膜片鉗技術(shù) 二、通道藥理學(xué) 三、通道蛋白分離、通道重建 四、通道蛋白表達(dá)水平的檢測 五、基因結(jié)構(gòu)

2、六、Ｘ射線晶體成像技術(shù)第三節(jié) 離子通道的生理功能第四節(jié) 離子通道與疾病第五節(jié) 離子通道的應(yīng)用及展望,The Structure of the Cell Membrane,Transport of Substances Through the Cell Membrane,Simple diffusionMembrane protein mediated transportEndocytosis and exocytos

3、is,Simple diffusion,Membrane Protein Mediated transport,Facilitated diffusion via CarrierFacilitated diffusion via ChannelPrimary active transportSecondary active transport,,,Secondary active transport,Endocytosis an

4、d exocytosis(need energy from ATP),Endocytosis Phagocytosis; PinocytosisExocytosis,第一節(jié) 離子通道概述,概念： 離子通道是細(xì)胞膜上的一類特殊的蛋白質(zhì)，可以選擇性讓離子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。,離子通道的發(fā)現(xiàn),1890年，德國物理化學(xué)家 Wilhelm Ostwald首先提出，生物體內(nèi)的電信號是離子進(jìn)出細(xì)胞膜而產(chǎn)生的。 1

5、909年諾貝爾化學(xué)獎 20世紀(jì)20年代，科學(xué)家證實(shí)存在一些供離子出入的細(xì)胞膜通道。1950年代初，兩位英國科學(xué)家Alan Hodgkin和 Andrew Huxley用槍烏鰂大神經(jīng)軸突的電壓鉗等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，鉀離子和鈉離子進(jìn)出神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而讓神經(jīng)信號傳遞下去。 他們因此獲得1963年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。但那時科學(xué)家未知離子通道結(jié)構(gòu)和工作原理。,電壓鉗技術(shù)記錄膜電流,,,內(nèi)向電流,外向電流,,,,,,0mV,

6、,20多年前，德國科學(xué)家薩克曼（Bert Sakman）和內(nèi)爾（Erwin Neher）用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞膜上單離子通道，發(fā)現(xiàn)當(dāng)離子通過細(xì)胞膜上的離子通道的時候，產(chǎn)生十分微弱的電流。他們因此重大成就而獲1991年諾貝爾生理學(xué)獎。,獲2003年諾貝爾化學(xué)獎的兩位科學(xué)家是美國人阿格雷（Peter Agre）和麥金農(nóng)（Roderick MacKinnon），他們的發(fā)現(xiàn)都涉及到了“細(xì)胞膜上的通道”。1998年羅德里克&

7、#183;麥金農(nóng)利用Ｘ射線晶體成像技術(shù)獲得了世界第一張離子通道的高清晰度照片，繪制出了世界上第一張離子通道（鉀離子通道蛋白質(zhì)）的三維結(jié)構(gòu)圖。第一次從原子層次揭示了離子通道的工作原理。這張照片上的離子通道取自青鏈霉菌。麥金農(nóng)的方法是革命性的，它可以讓科學(xué)家觀測離子在進(jìn)入離子通道前在通道中，以及穿過通道后的狀態(tài)。 1980年代中期，阿格雷發(fā)現(xiàn)了鑲嵌在細(xì)胞膜上的一種專門供水分子進(jìn)出的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)就是30多年來科學(xué)家一直尋找的“水通道”

8、——水分子進(jìn)出細(xì)胞的通道。,,鉀離子通道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)圖,,,一、分類,,門控: 控制通道功能狀態(tài)的通道蛋白分子內(nèi)部“閘門”樣結(jié)構(gòu)的運(yùn)動過程,根據(jù)門控機(jī)制的不同而分: 電壓門控通道(voltage-gated) 化學(xué)門控通道(ligand-gated) 機(jī)械性通道 (stress-activated)根據(jù)離子選擇性的不同而分為：鈉通道鉀通道鈣通道氯通道,,1 電壓門控性通道(voltage gated

9、),---由膜兩側(cè)電位差而控制開啟和關(guān)閉的通道。膜內(nèi)負(fù)電荷減少 Na+通道開放 胞外Na +進(jìn)入胞內(nèi)以最容易通過的離子命名： K+、Na+、Ca 2+、Cl-通道4種主要類型。,,,2 化學(xué)門控通道 (chemical gated),由化學(xué)信號控制開啟和關(guān)閉的通道。又稱配體門控性通道(ligand-gated)由化學(xué)物質(zhì)與通道蛋

10、白質(zhì)受體分子上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而開啟。 遞質(zhì)－－－－受體以遞質(zhì)受體命名，如 乙酰膽堿受體通道 谷氨酸受體通道 門冬氨酸受體通道. 非選擇性陽離子通道 (non-selective cation channels)是由配體作用于相應(yīng)受體而開放，同時允許Na+、Ca2+ 或K+ 通過。,,3 機(jī)械門控性通道(mechanically-gated),是一類感受細(xì)胞膜表面應(yīng)力變化，實(shí)現(xiàn)胞外機(jī)械信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的

11、通道。,二、通道的結(jié)構(gòu)（一）電壓門控通道,電壓門控鈉、鉀、鈣通道有相似結(jié)構(gòu):a b 亞單位, a 亞單位是形成孔道的單位；a亞單位含Ⅰ-Ⅳ 共4個結(jié)構(gòu)域;每個結(jié)構(gòu)域含6個跨膜 a螺旋. S1-S6.,結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ之間有使通道失活的結(jié)構(gòu),跨膜a螺旋: S1-S6S5 和 S6共同形成孔道，決定通道的離子選擇性和通透性,,,S4是電壓傳感器，與通道的激活機(jī)制有關(guān)（帶正電的aa) 結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ之間有使通道失活的結(jié)構(gòu),,三、離子

12、通道的特點(diǎn),1、離子選擇性 選擇性讓某種或某些離子通過通道 對離子的選擇性取決于：通道、離子的直徑離子的種類孔道上帶電的氨基酸Ach 陽離子通道口徑0.65nm,水合K+直徑0.396nm, 水合 Na+直徑0.512nm, K+和Na+都可通過通道,孔道外口和內(nèi)口有帶負(fù)電的氨基酸,故陰離子不能通過.,,2、門控性 通道開放或關(guān)閉取決于：膜電位（電壓門控） 化學(xué)信號（化學(xué)門控） 機(jī)械刺激 （機(jī)械門控）,離

13、子通道不同的功能狀態(tài)：,靜息 關(guān)閉，可激活激活 開放失活 關(guān)閉，不可激活,Characteristics of the voltage-gated sodium (top) and potassium (bottom) channels, showing successive activation and inactivation of th

14、e sodium channels and delayed activation of the potassium channels when the membrane potential is changed from the normal resting negative value to a positive value.,四 通道的激活1 跨膜電位差的改變,AP傳來, 神經(jīng)未梢膜去極化，電壓門控Ca2 +通道開放，Ca2

15、+內(nèi)流， Ach釋放,2 化學(xué)信號分子(遞質(zhì)或第二信使)與特異結(jié)合位點(diǎn)（受體）結(jié)合,受體本身即是通道 例如在終板膜上：Ach 與終板膜Ach受體(化學(xué)門控通道)結(jié)合；Ach受體陽離子通道開放（受體構(gòu)型改變）；鈉內(nèi)流為主，少量鉀外流， 產(chǎn)生終板電位；后者擴(kuò)布使鄰近肌膜去極化達(dá)閾電位，引發(fā)AP。,五 影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率的因素,膜兩側(cè)離子濃度差和電位差 正變膜通道的密度

16、 正變膜通道開放的數(shù)量 正變離子的性質(zhì)和通道的選擇性和通透性,六 通道轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn),1. 順電-化學(xué)差擴(kuò)散 （RP和AP的產(chǎn)生）離子轉(zhuǎn)運(yùn)的方向:順化學(xué)梯度 (從高濃度向低濃度側(cè)) 細(xì)胞外(mmol/L) 細(xì)胞內(nèi) (mmol/L) Na+ 145

17、 12 K+ 4 155順電梯度2. 不直接耗能需要Na+-K+泵建立和維持細(xì)胞膜內(nèi)外的離子的電化學(xué)梯度,細(xì)胞的靜息電位 (Resting Potential),靜息電位：細(xì)胞未受刺激時膜兩側(cè)的電位差。RP -10～-100mV,安靜時膜對鉀的通透性

18、較大; 鉀順濃度差外流, 促使鉀外流的鉀濃度勢能差 = 阻礙鉀外流的電勢能差 （鉀外流導(dǎo)致的外正內(nèi)負(fù)）RP相當(dāng)于Ek。,Nernst公式,,內(nèi),外,動作電位(action potential),膜對Na+通透性增大，Na+內(nèi)流 （膜外高Na+ ，膜內(nèi)負(fù)電）引起AP上升支,鈉內(nèi)流動力: 電驅(qū)動力 膜內(nèi)負(fù)膜外正 化學(xué)驅(qū)動

19、力 膜外高鈉鈉內(nèi)流阻力 鈉內(nèi)流形成的膜內(nèi)正外負(fù)的電場力,Na+-K+泵建立和維持細(xì)胞膜內(nèi)外Na+和K+的化學(xué)梯度 泵出3 Na+ ，泵入2 K+,,七、K＋、Na+、Ca2+、 Cl-通道,（一） K＋通道,,分二大類：內(nèi)向優(yōu)勢K＋通道 (inward rectifiers K (ir) ） 電壓門控K＋通道 （voltage-gated K (v)）,,內(nèi)向優(yōu)勢K＋通道 ： a voltage

20、driving a current into the cell produces a larger current than an identical voltage driving current out of the cell 時間依賴性失活 電壓依從性 電導(dǎo) 29pS in 145 mM K+, 3.6 pS in normal K+ 高度 K+ 選擇性 存在于骨骼肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞,鉀離子通道作用:,細(xì)胞

21、的生物電的產(chǎn)生調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)心率胰島素分泌、神經(jīng)細(xì)胞分泌、骨骼肌收縮細(xì)胞容積調(diào)節(jié)K＋通道阻斷劑：內(nèi)向優(yōu)勢K＋通道 Cs、Ba2+ 電壓門控性K＋通道 TEA,電壓依賴性鉀電流（Ikr）,臨床應(yīng)用： 抗心律失常藥-鉀通道阻滯藥（延長動作電位時程藥物）： 主要抑制Ikr鉀電流，延長心肌細(xì)胞動作電位時程，降低自律性，延長有效不應(yīng)期。,（二）Na+通道,Na+

22、通道是細(xì)胞產(chǎn)生動作電位的關(guān)鍵性通道。Na+通道阻斷劑：河豚毒 （tetrodotoxin，TTX) 普魯卡因,電壓依賴性鈉電流,Na+通道阻斷劑臨床應(yīng)用：抗心律失常藥 (作用于心肌細(xì)胞）局部麻醉藥和抗癲癇藥(作用于神經(jīng)細(xì)胞,阻抑AP傳導(dǎo)和產(chǎn)生）,,,Composed of α, β-1 and β-2 subunits, but, as with the calcium channel,

23、the large α-subunits carries most of the functional properties. E.g. when this subunit is expressed in Xenopus oocytes, a voltage-gated, toxin sensitive Na+ current is produced. The α-subunit is structurally similar to C

24、a2+ channels (see above) with longer intracellular linking loops but a shorter C-terminal. Within the α-subunit a motif of 300-400 amino acids is repeated 4 times, each repeated motif contains 6 predicted transmembrane d

25、omains, each of the 4 repeated motifs has an S4 domain containing positively charged residues that acts as the voltage sensor.The alpha subunit has the voltage sensing S4 region in each of the 4 repeats. View structure.

26、The intracellular loops have phosphorylation sites (P), and the extracellular loops have glycosylation sites (Y) and saxitoxin (ScTx) and tetrodotoxin (TTX) binding sites. The P-segments (a.k.a. H5 loops) form the lining

27、 of the pore. Voltage-gated sodium channels are responsible for the current underlying the rapid upstroke of the nerve and muscle action potential. They are very voltage-sensitive - at the resting potential the open prob

28、ability of Na+ channels is very low. Depolarization can increase open probability dramatically - Na+ enters causing further depolarization, opening more Na+ channels,細(xì)胞外 Ca 2+濃度 (1-2mM)顯著高于細(xì)胞內(nèi) Ca 2+濃度 (10-7M) 。Ca 2+ 作為第

29、二信使激活許多生理過程，與遞質(zhì)釋放,細(xì)胞分泌，收縮，運(yùn)動等功能密切相關(guān)。,（三）Ca2＋通道,,Calcium channels are composed of several subunits. Ten α1 subunits have been cloned. Voltage-dependent calcium channels exist as a complex of subunits including α1, α2, β,

30、γ, and δ. These subunits control the structure and activity of the α1 subunit. α1 has most of the functional properties. The α1 subunit is structurally similar to Na+ channels (see below) - with shorter intracellular lin

31、king loops but a longer C-terminal. Within the α1 subunit a motif of 300-400 amino acids is repeated 4 times, each repeated motif contains 6 predicted transmembrane domains, each of the 4 repeated motifs has an S4 domain

32、 containing positively charged residues that acts as the voltage sensor. P-segments from each repeat line the pore.,,At least 6 types of Ca2+ current have been identified: N, L, T, P，Q and R N-type: Activation : s

33、trong depolarization, inactivation: slow location : presynaptic nerve terminals, Major contribution in cortical neurons function: involved in “classical” transmitter release (e.g. ACh, NAdr). Block

34、er: ωCgTx (omega conus toxin)P-type: Activation: strong depolarization, inactivation : very slow. Blocker: Ftx (funnel web spider toxin). Insensitive to dihydropyridines. Now usuall

35、y referred to as P/Q-type T-type: Activation: small (~20mV) depolarizations, Inactivation: rapid (T = transient). location :Widely distributed in excitable and non-excitable cells. Function: Sup

36、port pacemaker activity and, in conjunction with IK,Ca, allow oscillations of membrane potential. Regulate intracellular Ca2+ concentration. Blocker: Ni2+.,L-type: Location: all excitable and many non-excitable cells.B

37、locker: dihydropyridines and verapamil. Insensitive to ωCgTx. function: transmitter release (peptide transmitters) in endocrine cells; contraction in heart and smooth muscle (E-C

38、 coupling). Q-type: Activation: strong depolarizationinactivating: FastLocation: cerebellar granule cells, hippocampal pyramidal neurones, heart, pancreas, pituitaryBlocker: ω-AgaIVA spider toxin Function:

39、transmitter release, excitation-secretion coupling in pancreatic. R-type: Location: neurones (brain), heart, testes, pituitary.Function: transmitter release.Blocker: ωCgTx MVllC.,,高電壓激活的鈣通道（high voltage activated，

40、HVA) 包括L- , P/Q-, N-, and R-型 通道激活需要約50mV以上的去極化。低電壓激活的鈣通道（Low voltage activated，LVA) 指T-型通道 通道激活僅需要約20mV的去極化.,,Ca 2+ 作為第二信使激活許多生理過程，與遞質(zhì)釋放,細(xì)胞分泌，收縮等功能密切相關(guān)。,鈣通道抑制劑的臨床應(yīng)用： 治療冠心病，心律不齊，高血壓,,Action potentia

41、ls of Cardiac Muscles and Smooth muscles,1. Ca2＋ channels (sodium-calcium channels) responsible for the depolarization of action potentials in sinus node cells of the heart and in smooth muscle cells.responsible for t

42、he formation of AP plateau in ventricular and atrial cells. responsible for the autorhythmicity. 2. Na+ channels: responsible for the depolarization of action potentials in atrial and ventrical cells of the heart 3.

43、K+ channels: responsible for the depolarization of action potentials,The action potential and ionic flows in a ventriclar myocardial cell,The action potential and ionic flows in a sinus node cell,鈣參與形成(臨床應(yīng)用基礎(chǔ)):,心肌細(xì)胞收縮心

44、室肌細(xì)胞動作電位平臺期鈣內(nèi)流竇房結(jié)細(xì)胞0期和4期去極化血管平滑肌0期去極化(平滑肌細(xì)胞緊張性),（四）Cl-通道,分類： CLC CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) calcium-activated Cl channel (CLCA-n) ligand-gated anion channels (GABAA and glycine

45、receptors) Cl-通道調(diào)節(jié)物： MDR1, pICln, mat-8, phospholemman,,Cl-通道參與膜電位的形成,細(xì)胞內(nèi)PH的調(diào)節(jié),容積調(diào)節(jié),上皮細(xì)胞分泌等.,1、ClC family,ClC-0; torpedo electroplax; 10pS ClC-1; mammalian muscle; 1pS ClC-2; ubiquitous; 3-5pS and also ClC-K1 and C

46、lC-K2 which are rat kindey-specific transcripts of ClC-2 ClC-3; volume-activated chloride channel (present in all cells??) - however recent ClC-3 -/- knock-out mouse still has volume regulation ClC-4; mammalian muscle,

47、 brain, liver, kidney, spleen; 140pS ClC-5; kidney ClC-6 and -7; present in most tissues but not functionally expressed as Cl- channels (intracellular organelle channels),,Recently the structure of the CLC family of ch

48、annels has been determined by X-ray crystallography of a bacterial version of the protein. There are 18 α-helices of which 17 are in the membrane. The α-helices lie at different angles to each other and to the membrane s

49、urface so they have a variety of different lengths.,容積激活性氯通道抑制劑：,NPPBTamoxifenATPDIDS,2 囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR),分布：哺乳動物上皮細(xì)胞電導(dǎo)：6-10pS 功能：上皮細(xì)胞液體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 其基因突變時導(dǎo)致囊性纖維化因 cAMP

50、或細(xì)胞內(nèi)的鈣升高而激活 12-transmembrane domains, 2 NBF (nucleotide binding folds) and 1 R-domain (regulatory domain),3 鈣激活的氯通道 （ICl,Ca and CaCC）,分布：腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞作用： 與內(nèi)分泌腺和外分泌腺分泌有關(guān) 與上皮細(xì)胞跨膜液體轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān) 影響神經(jīng)元和肌細(xì)胞的興奮性 卵母細(xì)胞受精,4 g -氨基丁酸促離子型受

51、體 （g -aminobutyric acid, GABAA）,屬配體門控通道，γ－氨基丁酸激活GABAA受體，受體本身是氯通道分布于幾乎所有神經(jīng)元, 突觸前和突觸后,,作用: 介導(dǎo) CNS 中的快速突觸抑制臨床應(yīng)用：抗驚厥劑，催眠藥，肌松藥，鎮(zhèn)靜藥　苯(并)二氮卓類（BENZODIAZEPINE）促進(jìn)通道開放　巴比妥酸鹽 （Barbiturate）延長通道開放時間,5 甘氨酸受體（ Glycine receptor

52、s ）,甘氨酸激活甘氨酸受體 (受體本身是氯通道）主要分布于脊髓和腦干作用：引起抑制 α -subunits contain the agonist and antagonist binding sites.拮抗劑：士的寧（Strychnine）,MDR1,MDR與耐藥性有關(guān)（藥物泵）。 Cl- 通道調(diào)節(jié)物。,第二節(jié) 離子通道研究方法與技術(shù),綜合應(yīng)用各種技術(shù)：膜片鉗技術(shù)通道蛋白分離、純化等生化技術(shù)人工膜離子通道重建技術(shù)

53、通道藥物學(xué)基因重組技術(shù)Ｘ射線晶體成像技術(shù),一、膜片鉗技術(shù),膜片鉗技術(shù)是用來測量離子通道跨膜電流和研究分子的非中性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的技術(shù)。獲1991年諾貝爾生理科學(xué)獎。膜片鉗技術(shù)是將尖端直徑僅1mm 的玻璃微電極接觸細(xì)胞膜，施加負(fù)壓使微電極與細(xì)胞膜之間形成10G?以上的高阻抗封接，使電極尖端開口處相接的細(xì)胞膜的膜片與周圍環(huán)境在電學(xué)上隔離，并通過外加命令電壓鉗制膜電位，對此膜片上的離子通道電流進(jìn)行監(jiān)測。,兩種工作模式：,電壓鉗模式（volt

54、age mode）： 對細(xì)胞進(jìn)行電壓鉗制， 即利用電子學(xué)技術(shù)施加一跨膜電壓并把膜電位固定于某一數(shù)值，從而實(shí)驗(yàn)性調(diào)節(jié)或控制膜片或全細(xì)胞電壓，可以測定該膜電位條件下離子電流隨時間變化的動態(tài)過程。研究電壓依賴性離子通道。電流鉗模式（current mode）： 通過電流鉗制，改變跨膜離子流來監(jiān)測細(xì)胞膜電位的變化，從而可以觀察各種離子通道電流及其調(diào)控,膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用：,利用藥物或改變細(xì)胞內(nèi)外的溶液成分，使其他離子通道失效，即可測定

55、被研究的某種離子通道的功能性參量，分析離子電流的穩(wěn)態(tài)和動力學(xué)與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系，可推斷該種通道的電導(dǎo)、活化和失活速率、離子選擇性等，并能測量和分析通道的門控電流的特性。膜片鉗技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個學(xué)科，尤其在遞質(zhì)、激素、藥物作用機(jī)制研究、尋找藥物最佳靶點(diǎn)、新藥開發(fā)等方面更具有其獨(dú)特優(yōu)越性。,膜片鉗方法,,,,全細(xì)胞電流（容積激活性氯電流）,Whole-cell currents under isotonic and

56、47% hypotonic conditionsTypical current traces, representative of 30 cells, recorded under isotonic bath conditions and at the peak of the hypotonic response are showed in A and B. The protocol of voltage clamp was gi

57、ven in C. The voltage was held at 0 mV and then stepped to 0, ? 40, ? 80 mV with an interval of 4 sec between steps.,250 ms,2 nA,B. Hypo,A. Iso,C.,0,Time course of volume-activated whole-cell current The value o

58、f the whole-cell current taken 10 ms after the start of each voltage step (0, ? 40, ? 80 mV) is plotted as a function of time. Similar results were observed in 30 cells. Currents in response to all these voltage steps we

59、re small and stable when the cells were bathed in isotonic solution (indicated by the first Iso bar). The currents began to increase in 1-2 min after the application of a 47% hypotonic solution (indicated by the Hypo bar

60、). The activated currents reached the peak and levelled off 3-5 min after the exposure to hypotonic solution and then recovered partially after returning to the isotonic solution (indicated by the second Iso bar). The re

61、sidual currents were abolished by a 47% hypertonic solution (indicated by the Hyper bar).,單通道記錄,用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面,使之形成10～100GΩ的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面積為μm2量級,內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對該膜片實(shí)行電壓鉗位，可測量單個離子通道開放產(chǎn)生的pA（10-12安培）量級的電流，這種通道開放是一種

62、隨機(jī)過程。通過觀測單個通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細(xì)胞膜上分離出來，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。這種技術(shù)對小細(xì)胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便。,,二、通道藥理學(xué)研究,通道拮抗劑、激動劑等 區(qū)分離子流

63、 通道功能 鈣通道阻斷劑 鈣電流變化 心肌細(xì)胞反應(yīng),,,,,藥物影響通道的方式:,改變激活延緩或加快通道的失活阻抑離子流動,影響電壓門控性鈉通道的藥物及毒素,1. 通道阻斷劑 : 河豚毒 (tetrodotoxin，ＴＴＸ)　　與神經(jīng)細(xì)胞，肌細(xì)胞有高親合力　　結(jié)

64、合位點(diǎn)在Ｓ５－Ｓ６．2. 持續(xù)的通道激活：蛙毒（batrachotoxin）3. 延緩?fù)ǖ赖氖Щ睢⌒舅?a- scorpion toxins4. 改變通道失活的電壓依賴性: 腰鞭毛蟲毒素brevetoxin,,Time course of NPPB inhibition of volume-activated chloride currents in CNE-2Z cellsThe whole-cell current,

65、measured 10 ms after the start of each 200 ms voltage step (0, ? 40, ?80 mV; 4s interval), was plotted against time. A 47% hypotonic solution was introduced into bath, as indicated by the Hypo bar. Once currents began to

66、 plateau, cells were perfused with 47% hypotonic solution containing 100 mM NPPB, as indicated by the NPPB bar.,三、通道蛋白分離、通道重建,利用與通道特異結(jié)合的毒劑標(biāo)記，可把通道蛋白質(zhì)從膜上分離下來，經(jīng)過純化，然后做通道蛋白質(zhì)的序列測定。把人工合成或分離的通道蛋白質(zhì)裝在人工膜，觀察通道功能。,,20世紀(jì)80年代中期，美國科

67、學(xué)家Peter Agre發(fā)現(xiàn)一種被稱為水通道蛋白的細(xì)胞膜蛋白就是人們尋找已久的水通道。為了驗(yàn)證自己的發(fā)現(xiàn)， Peter Agre把含有水通道蛋白的細(xì)胞和去除了這種蛋白的細(xì)胞進(jìn)行了對比試驗(yàn)，結(jié)果前者能夠吸水，后者不能。為進(jìn)一步驗(yàn)證， Peter Agre制造了兩種人造細(xì)胞膜，一種含有水通道蛋白，一種則不含這種蛋白。他將這兩種人造細(xì)胞膜分別做成泡狀物，然后放在水中，結(jié)果第一種泡狀物吸收了很多水而膨脹，第二種

68、則沒有變化。這些充分說明水通道蛋白具有吸收水分子的功能，就是水通道。,四、通道蛋白表達(dá)水平的檢測,Western blot免疫熒光檢測,,五、研究編碼離子通道的基因結(jié)構(gòu),基因定位克隆、聚合酶鏈反應(yīng)、Northern 、 Western 、核酸雜交等分子生物學(xué)方法。,六、Ｘ射線晶體成像技術(shù),1998年，羅德里克·麥金農(nóng)利用Ｘ射線晶體成像技術(shù)獲得了世界第一張離子通道的高清晰度照片，并第一次從原子層次揭示了離子通道的工作原理。這張