8 人工種子

1、人工種子,體細(xì)胞胚的發(fā)生和人工種子制作,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,種子seed,裸子植物和被子植物特有的繁殖體由胚珠經(jīng)過傳粉受精形成,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,種子結(jié)構(gòu),種皮保護(hù)作用胚乳為發(fā)育中的胚提供營養(yǎng)胚發(fā)育成新的植物體,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,單子葉植物種子結(jié)構(gòu),子葉,上胚軸,胚根

2、,胚乳,人工種子的定義,別名：合成種子、人造種子、無性種子、種子類似物將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體（體胚）或者能發(fā)育成完整植株的分生組織（不定芽、小鱗莖、短枝、毛狀根、愈傷組織等），包裹在有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的物質(zhì)中形成的類似于天然植物種子的結(jié)構(gòu)，并在適宜條件下發(fā)芽出苗的顆粒體。,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,人工種子結(jié)構(gòu),最外面一層是人工種皮人造的化合物，維持胚狀體正常發(fā)育透水透氣、固定

3、成型、耐機(jī)械沖擊中間是人工胚乳營養(yǎng)成份和生長調(diào)節(jié)劑種子內(nèi)面則是被包埋的胚狀體或類似物具生命的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)育成植物體,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,半夏人工種子,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,概念的提出,1978年，加拿大，第四屆國際植物組織培養(yǎng)會議利用植物組織培養(yǎng)中具有體細(xì)胞胚胎發(fā)生的特點(diǎn)著名的植物組培專家Murashige首次提出“人工種子

4、”的概念人工種子具有巨大的應(yīng)用潛力，引起了各個國家的高度重視，列入高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,種子導(dǎo)彈,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,一、為什么要進(jìn)行人工種子研究？,人工種子不僅能像天然種子一樣可以貯存、運(yùn)輸、播種、萌發(fā)和成長為正常植株人工種子技術(shù)有著誘人的前景,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.c

5、n,第一，培養(yǎng)條件可以人為控制，免遭大自然災(zāi)害性氣候的影響，且具有省地、省工、可直接在田間播種等優(yōu)點(diǎn)第二，在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等，使長成的植株具備優(yōu)良特性,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,第三，用于制作人工種子的體細(xì)胞胚，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術(shù)加速用于

6、生產(chǎn),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,1生產(chǎn)不受自然條件的限制和土地的制約,天然種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上受季節(jié)限制一般1年只能繁殖1-2次人工種子可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量生產(chǎn)，不受限制一個體積為12L的發(fā)酵罐在二十天內(nèi)可生產(chǎn)1000萬粒人工種子,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,2快捷高效的繁殖方式，縮短育種時(shí)間,一個新的水稻品種用常規(guī)方法培育需要七到八年時(shí)間而用人工

7、種子與常規(guī)育種結(jié)合良種繁育技術(shù)減少了移栽馴化過程，只需三四年時(shí)間,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3人為賦予種子多種優(yōu)良品質(zhì),在人工種子的制作過程中，可以加入某些農(nóng)藥、有益微生物或生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，人為地控制植物的生長發(fā)育，播種后生長出來的植物就有一定的抗逆性通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使離體培養(yǎng)的“胚”具有優(yōu)良特性,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,4固定雜種優(yōu)勢,天然種

8、子是有性繁殖獲得的，在遺傳上具有因減數(shù)分裂引起的遺傳重組分離現(xiàn)象雜種優(yōu)勢只能體現(xiàn)在F1代，而F2代便參差不齊了人工種子屬于無性繁殖范疇，可以保持雜種優(yōu)勢對于一些自然繁殖困難的名貴品種，也可通過人工種子進(jìn)行快速大量繁殖,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,植物人工種子技術(shù)內(nèi)容,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,二、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬

9、 lbhuang@shou.edu.cn,1.體細(xì)胞胚的概念,由孢子體或配子體的細(xì)胞通過無性繁殖產(chǎn)生的一種類似于合子胚的結(jié)構(gòu)主要指在組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，起源于非合子細(xì)胞（體細(xì)胞）并經(jīng)過多次分裂產(chǎn)生的一種與胚相似的結(jié)構(gòu),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,2體細(xì)胞胚的特點(diǎn),組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物起源于體細(xì)胞（非合子細(xì)胞），區(qū)別于由卵和精子受精形成的合子胚具有胚根、胚芽和胚軸的完整結(jié)構(gòu)發(fā)育過程

10、與合子胚相同原胚→心形胚→魚雷形胚→具子葉的成熟胚,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,擬南芥植物野生型的胚胎發(fā)育階段,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,心形胚,魚雷形胚,成熟胚,原胚,芒果體胚發(fā)生由球型胚(A)，心型胚(B)，進(jìn)入魚雷胚(C)，萌芽(D)至植株再生(E)情形,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3體細(xì)胞胚來源

11、,1958年，Reinert在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最早發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞胚至今已從43科，92屬，100種以上植物中獲得了體細(xì)胞胚,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3-1 從器官上發(fā)生,離體培養(yǎng)的器官在一定條件下可以從外植體上直接產(chǎn)生胚狀體器官外植體的表皮細(xì)胞外植體內(nèi)部的薄壁細(xì)胞子葉和下胚軸：最容易誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3-2 從

12、愈傷組織上發(fā)生,最常見的方式離體器官——愈傷組織——胚狀體 脫分化 分化能產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織：胚性愈傷組織多數(shù)來自callus的表面細(xì)胞：玉米、西洋參少數(shù)來自callus的內(nèi)部：獼猴桃,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,①,②,體胚原始細(xì)胞的特點(diǎn)原生質(zhì)較濃細(xì)胞核顯著增大、位于細(xì)胞質(zhì)的中央,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 l

13、bhuang@shou.edu.cn,原始細(xì)胞,頂端細(xì)胞,基 細(xì)胞,原胚,體胚,,胚柄,3-3 從游離的單細(xì)胞發(fā)生,體細(xì)胞分離的原生質(zhì)體小孢子等在胡蘿卜上研究較多,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,體細(xì)胞胚,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,制作人工種子的核心保證人工種子具有發(fā)芽力及轉(zhuǎn)換為正常植株體胚的誘導(dǎo)獲得高質(zhì)量的體胚要求體胚發(fā)育完整、生

14、長健壯在無菌試管培養(yǎng)條件下，有90%以上的體胚能正常萌發(fā)并轉(zhuǎn)換為完整小植株,體胚轉(zhuǎn)換過程,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,4 影響體胚發(fā)生和發(fā)育的因素,胚狀體的誘導(dǎo)和發(fā)生是一個十分復(fù)雜的過程大量研究：形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)等不同的角度其機(jī)理至今仍不清楚，亟需解決植物材料的內(nèi)在因素和組織培養(yǎng)的外部條件影響胚狀體的發(fā)生和發(fā)育,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@sh

15、ou.edu.cn,4-1 供體植物的基因型,a不同物種產(chǎn)生胚狀體的能力不同茄科植物矮牽牛：容易產(chǎn)生胚狀體煙草：很少產(chǎn)生，一般通過根芽的分化形成再生植株,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,b同一物種的不同品種之間產(chǎn)生胚狀體的能力也不同水稻的11個品系1個品系的callus能產(chǎn)生胚狀體紫狼尾草的21個品系19個品系產(chǎn)生胚狀體2個品系不能形成,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuan

16、g@shou.edu.cn,4-2 外植體的來源,大多數(shù)植物只有處于一定發(fā)育階段的某一種器官的外植體能產(chǎn)生胚狀體雙子葉植物：下胚軸和子葉禾谷類：幼胚的盾片和幼穗大黍：結(jié)構(gòu)已發(fā)育完全但尚未伸展的黃綠色幼葉才能產(chǎn)生胚性愈傷組織長春藤：成熟的莖段,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,芹菜、人參、葡萄、甘蔗的組織培養(yǎng)離體產(chǎn)生的胚狀體可以再次作為外植體，經(jīng)繼代培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量的次級和三級胚狀體利用胚

17、狀體進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)快速繁殖種苗,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,在繼代培養(yǎng)過程中，胚狀體的發(fā)生能力會逐漸降低染色體發(fā)生倍性改變和畸變例外：柑橘的callus分化胚狀體的能力能保持8年以上,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,不同植物callus分化胚狀體的速度不同咖啡：70天人參：8個月,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.c

18、n,4-3培養(yǎng)物的生理狀況,培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)源激素水平不同采樣時(shí)期的外植體采用增殖能力較強(qiáng)的外植體獲得較多的體細(xì)胞胚,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,4-4 培養(yǎng)物的倍性,體細(xì)胞胚可以從不同倍性的組織中獲得單倍性的小孢子（花粉）二倍體、三倍體、多倍體體細(xì)胞倍性水平不影響體細(xì)胞胚的發(fā)生但體細(xì)胞胚的發(fā)育和轉(zhuǎn)換過程會有差異,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.c

19、n,4-5 培養(yǎng)基中的外源激素,根據(jù)不同植物對外源激素的需求分3種情況①全過程不需要外源激素添加少量會提高誘導(dǎo)頻率②誘導(dǎo)胚狀體的全過程需要外源激素較高的激動素和生長素的配比才有較高的頻率（咖啡）③前期需要激素，后期不需要或極低濃度即可常見，激素誘導(dǎo)出后callus，誘導(dǎo)胚狀體無需激素（或很低）,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,生長素auxin,在不少植物中已被證明是胚胎發(fā)育所必須的2

20、,4-D是誘導(dǎo)多種植物離體培養(yǎng)的體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胚性細(xì)胞的重要激素，其次是NAA據(jù)Evans等分析有57.7%的雙子葉植物和所有的單子葉植物在其體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)階段都使用2,4-D,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,2,4-D,絕大多數(shù)研究證明：極為重要的誘導(dǎo)因子外植體細(xì)胞脫分化愈傷組織脫分化愈傷組織誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成單子葉植物要求濃度較高：0.5mg～5mg/L雙子葉植物要求濃度較

21、低：0.02mg~1mg/L,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,不同植物的體胚發(fā)生，要求不同的激素種類顛茄：NAA和激動素南瓜：NAA和IBA,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,細(xì)胞分裂素CTK,裸子植物，CTK的作用比生長素更重要，特別有利于子葉的發(fā)育添加生長素可提高體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.c

22、n,玉米素一種天然的細(xì)胞分裂素促進(jìn)胡蘿卜體胚的發(fā)生獼猴桃的胚乳callus只有在培養(yǎng)基中添加玉米素才能分化出體胚,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,其他激素,ABA（脫落酸）生長抑制劑抑制次級胚和不正常胚的產(chǎn)生并促進(jìn)正常胚的發(fā)育和成熟GA3（赤霉素）促進(jìn)生長的激素，多數(shù)植物不需要在誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的時(shí)候起抑制作用能解除花菱草體細(xì)胞胚的休眠,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang

23、@shou.edu.cn,4-6 培養(yǎng)基成分對體胚形成的影響,還原態(tài)的氮（銨鹽）的濃度直接影響胚狀體的誘導(dǎo)效果MS培養(yǎng)基>White培養(yǎng)基故：MS培養(yǎng)基比White培養(yǎng)基對胚狀體的形成有更好的效果培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮源（水解酪蛋白、氨基酸）有利于胚狀體的發(fā)生,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,①氮N源,碳水化合物能維持組織培養(yǎng)中外植體的滲透壓，同時(shí)又作為體胚發(fā)育的能源其種類和濃度可以影響

24、體胚的生長發(fā)育蘋果葉片離體培養(yǎng)時(shí)，在保證C源供應(yīng)的前提下，降低蔗糖濃度有利于體胚發(fā)生高濃度的葡萄糖（6-10%）有利于胡蘿卜的體胚發(fā)育,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,②碳C源,椰子乳被認(rèn)為是對體胚發(fā)生最有效的物質(zhì)液體胚乳，對胚的生長發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用其它未成熟的胚乳玉米胚乳、水稻胚乳、小麥胚乳對胚的生長也有一定作用酵母、麥芽、酪蛋白等提取物對促進(jìn)體胚的產(chǎn)生和發(fā)育，都是較為有效的天

25、然物質(zhì),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,③天然提取物,吸附一些外植體分泌出的有毒物質(zhì)提高體胚的誘導(dǎo)頻率和生長發(fā)育,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,④活性炭,4-7環(huán)境因子,光照煙草體胚發(fā)生需要高強(qiáng)度的光照胡蘿卜：完全黑暗也可完成高強(qiáng)的白光、藍(lán)光抑制胡蘿卜體胚發(fā)生和生長藍(lán)光可促進(jìn)心形胚中ABA(脫落酸)的合成紅光促進(jìn)心形胚的發(fā)育遠(yuǎn)紅光的短時(shí)間照射

26、可以促進(jìn)體細(xì)胞胚的發(fā)生,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,光照,溫度研究不多在花粉胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)中被證明是有效的在柑橘屬callus誘導(dǎo)培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)溫度的下降胚胎發(fā)生能力下降對花菱草體細(xì)胞胚的冷處理可以部分解除其休眠狀態(tài),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,溫度,體胚的培養(yǎng)可以從液體到半固體范圍內(nèi)進(jìn)行一般認(rèn)為：培養(yǎng)器的種類、胚在培養(yǎng)基中的狀態(tài)（浸入或漂

27、?。┖团囵B(yǎng)基的物理狀態(tài)（半固體或液體，通氣性）對胚的形成和發(fā)育影響很小,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,培養(yǎng)基狀態(tài),培養(yǎng)器的種類,三、體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,為什么要進(jìn)行同步控制？,體胚發(fā)生的不同步性是普遍現(xiàn)象在同一外植體上有不同發(fā)育時(shí)期的體胚對于研究體胚的分化機(jī)制和生化調(diào)控帶來麻煩不利于人工種子的制作和生產(chǎn),上海海洋大

28、學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,如何進(jìn)行同步控制,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,1.同步脫分化,在細(xì)胞培養(yǎng)初期加入DNA合成抑制劑（5氨基尿嘧啶），使其暫停DNA合成12～24h處理除去抑制劑后細(xì)胞開始進(jìn)入同步分裂10~16h，細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂高峰低溫處理抑制細(xì)胞分裂，然后把溫度提高到正常水平，亦能達(dá)到部分同步化的目的,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lb

29、huang@shou.edu.cn,2.分離過篩,根據(jù)體細(xì)胞胚發(fā)育的各個階段細(xì)胞大小不同，利用尼龍篩過濾或密度梯度離心法獲得大小均一的胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)重復(fù)幾次過濾、培養(yǎng)、再過濾，90 %的胚狀體能同步發(fā)育，達(dá)到成熟階段該方法較實(shí)用、快速，是同步化控制中最常使用的手段,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,采用不同目數(shù)的濾網(wǎng)收集體細(xì)胞胚，如對云南大葉茶體細(xì)胞胚進(jìn)行篩選6~20

30、目之間可收集到較大的子葉分化期體細(xì)胞胚20-40目為長梨形或魚雷形胚40~70目為心形和球形胚7o~100目為球形胚100~150目為多細(xì)胞團(tuán)塊,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,網(wǎng)孔目數(shù)指的是每平方厘米(cm2)絲網(wǎng)所具有的網(wǎng)孔數(shù)目,將心形胚、魚雷形胚及魚雷形偏后期胚轉(zhuǎn)入液體生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，50 d內(nèi)就發(fā)育成熟而球形胚需再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)一步分化100~150目的多細(xì)胞團(tuán)塊則不

31、能在液體生長培養(yǎng)基中分化,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3.在懸浮培養(yǎng)中控制通氣,在煙草的組織培養(yǎng)中，乙烯的產(chǎn)生與細(xì)胞生長有密切的關(guān)系在細(xì)胞生長達(dá)到高峰前有一個乙烯合成高峰可通過乙烯來控制每隔10或20h通入乙烯到培養(yǎng)基中（3-4s）,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,4. 利用滲透壓控制,不同發(fā)育階段的體胚具有不同的滲透壓球形胚：17.5%心形

32、胚：12.5%魚雷形胚：8.5%成熟胚：0.5%通過改變培養(yǎng)基的滲透壓使其停留于某一階段，然后通過降低蔗糖濃度，是胚狀體進(jìn)入同步發(fā)育的狀態(tài),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,四、人工種子的包裹,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,1人工種子的基本要求,① 要有健壯的具有高轉(zhuǎn)換率的體胚② 對包裹材料的要求對體胚無損傷、無毒性經(jīng)得起在儲藏、運(yùn)輸和種植過程

33、中的一般操作③ 人工種子中應(yīng)含有易釋放的養(yǎng)分和發(fā)育調(diào)節(jié)劑④ 價(jià)廉物美、適合農(nóng)業(yè)機(jī)械化播種,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,用于生產(chǎn)人工種子的植物①具有堅(jiān)實(shí)組培工藝基礎(chǔ)的作物（已具備能生產(chǎn)高質(zhì)量體胚的實(shí)驗(yàn)體系）苜蓿、胡蘿卜、香菜等② 具有強(qiáng)大商業(yè)基礎(chǔ)及工藝基礎(chǔ)的作物芹菜、萵苣、番茄、玉米等一般來講，農(nóng)業(yè)、林業(yè)及園藝上大面積推廣的優(yōu)良作物品系、優(yōu)質(zhì)蔬菜、名貴藥材等都可作為對象,上海海洋大

34、學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,2 人工胚乳,在自然種子中，作為合子胚發(fā)育而存在的營養(yǎng)倉庫——胚乳人工胚乳的目的也是要通過各種必需物質(zhì)的組合為體胚創(chuàng)造出一個微小的含有膠質(zhì)的營養(yǎng)成份環(huán)境，為體胚轉(zhuǎn)換時(shí)提供物質(zhì)營養(yǎng),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,糖類,既可以作為繁殖體生長的碳源物質(zhì)，叉可以改變包被體系中的滲透勢，防止?fàn)I養(yǎng)成分外泄，還能在人工種子低溫儲藏過程中起保護(hù)作用

35、目前用于人工胚乳中的糖類主要有蔗糖、麥芽糖、果糖和淀粉等其中以蔗糖應(yīng)用最為廣泛，促進(jìn)人工種子轉(zhuǎn)化成苗的效果也相對較好,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,葉志毅等(2001) 制作桑樹(Morus alaba)體細(xì)胞胚人工種子時(shí)發(fā)現(xiàn)，與果糖相比，蔗糖更利于人工種子的發(fā)芽和生長不同蔗糖濃度對人工種子萌發(fā)的影響也不同Adriani等(2000)對獼猴桃(Actinidia deliciosa)不定

36、芽的包被過程中，發(fā)現(xiàn)增加蔗糖的濃度可增加其轉(zhuǎn)化率但也有研究表明蔗糖的作用不及麥芽糖好,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,淀粉,淀粉在人工種子包被中應(yīng)用也比較廣泛淀粉可以在膠囊中分解，為植物繁殖體的發(fā)育提供碳源支持 Redenbaugh等(1987)在制作苜蓿體細(xì)胞胚人工種子時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯淀粉能代替麥芽糖，使體胚轉(zhuǎn)化率達(dá)35.4%,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu

37、.cn,黃紹興等(1995) 對木薯淀粉研究還發(fā)現(xiàn)淀粉分子多孔狀的結(jié)構(gòu)可以改變海藻酸鈣膠囊的致密結(jié)構(gòu)，從而增加膠囊的透氣性、保水性和吸水性，提高了人工種子的萌發(fā)率在實(shí)際操作中，幾種碳源成份配合使用也可以達(dá)到很好的效果,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),在人工胚乳中加入BA、IAA、GA3、NAA、ABA等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以促進(jìn)體細(xì)胞胚胚根、胚芽的分化與生長，還可以促進(jìn)非體

38、細(xì)胞胚繁殖體轉(zhuǎn)化成苗,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,Antonietta等(1998) 包被茶枝柑(Citrus reticulata)的體細(xì)胞胚人工種子，發(fā)現(xiàn)在人工胚乳中附加GA3能夠使其萌發(fā)率由26.7%提高到50%,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,在半夏(Pinellia ternata)小塊莖人工種子中添加GA3和NAA可使其較易生根，成活率提高

39、Saiprasad等(2003) 包被蘭屬(Orchid)植物球莖體，附加BA（0.44 μmol/L，人工合成的細(xì)胞分裂素）和NAA（0.54 μmol/L），可使其轉(zhuǎn)化成苗率達(dá)100%,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,金屬離子,Ca2+可以作為很好的海藻酸鈉的離子交換劑，用于人工種子包被中，對繁殖體的萌發(fā)與轉(zhuǎn)化不造成影響,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,

40、藻酸鹽的水凝膠膠囊系統(tǒng),在海藻酸鈉溶液中加入MS或White等培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、有機(jī)物質(zhì)等基本成分，將它們混合制成膠囊丸為了促進(jìn)體胚的生長，在人工胚乳中也加入促進(jìn)胚根、胚芽生長的植物激素或有益微生物、殺蟲劑、除草劑等農(nóng)用化學(xué)藥品，人為影響植物的抗逆性,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,3 包裹材料的選擇,包裹后膠囊硬度較為合適，且對體胚發(fā)育無明顯不利影響的凝膠海藻酸鈉：普遍采用，從海藻

41、中提取的多糖高分子化合物優(yōu)點(diǎn)：使用方便、無毒性、價(jià)格低廉和具有一定的強(qiáng)度缺點(diǎn)：“易漏”，水溶性養(yǎng)分容易滲漏，易干,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,涂抹其它材料形成外包膜,1987年，發(fā)現(xiàn)疏水性物質(zhì)Elvax-4260（乙烯、乙烯基乙配和丙烯酸共聚物）能在一定程度上減少人工種子之間的粘連，并明顯減輕蒸發(fā)失水，涂抹后的苜蓿人工種子仍可正常發(fā)芽1990年，半疏水性膜操作簡便，且能夠減少蒸發(fā)，對促進(jìn)

42、胡蘿卜種子在土壤的萌發(fā)有一定作用，而親水性外膜無明顯效果,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,解決 辦法-1,1993年，利用脫乙烯殼聚糖涂抹海藻酸鈉包被的油菜體細(xì)胞胚，發(fā)芽率達(dá)100%1994年，以1～5 %丙烯酸樹脂溶液成膜10 min制作的外膜涂抹水稻人工種子效果較佳1996年，石蠟?zāi)軌蛴行У乇缓娓刹⒕哂幸欢ǖ膶ρ醯臐B透性，用0.4 mm的石蠟涂抹包被的細(xì)胞團(tuán)，在空氣中（25 ℃）儲存60

43、 d仍可達(dá)到90%的轉(zhuǎn)化率,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,在海藻酸鈉膠囊外面再包被一層海藻酸鈉的方法也能達(dá)到與其他涂膜相同的效果在包被蘋果頂芽時(shí)，采用兩層包被的方法，較一層包被的轉(zhuǎn)化率（40％）相比可提高到70％,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,添加助劑,添加纖維素衍生物 、活性炭和高分子化合物等1990年，在胡蘿卜人工種子的研究中加入在MS培養(yǎng)基中浸

44、泡過的活性炭，可以有效地減少營養(yǎng)成分的泄漏,1995年，在安祖花人工種子中加入0.1 %的活性炭，不僅有效控制了營養(yǎng)物質(zhì)的散失，也使其黃褐化率降低，萌發(fā)率和轉(zhuǎn)化率提高,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,解決 辦法-2,在水稻人工種子中添加聚乙烯吡咯啉酮和聚乙烯醇高分子聚合物，形成的顆粒粘連少、較分散，且不易失水變形在海藻酸鈉中加入多糖、樹膠、高嶺土可減慢凝膠脫水速度，并提高了干化胡蘿卜體細(xì)胞胚的

45、活力,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,兩種措施結(jié)合使用， 可以更好地解決海藻酸鈣膠囊的缺陷1995 年，在安祖花人工種子胚乳中加入活性炭并用酯類共聚物涂抹使安祖花人工種子在有菌條件下的轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.4%，較只加活性炭（42.5%）的情況要高,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,

46、解決 辦法-3,人工種皮軟化,另外，海藻酸鈉包被的人工種子經(jīng)低溫儲藏后，易在表面形成堅(jiān)硬的外殼而妨礙了人工種子的萌發(fā)KNO3 可用作海藻酸鈉包被人工種子的軟化劑，K +置換海藻酸鈣中的Ca2+以達(dá)到軟化的效果2001年， Guerra等用100 μmol/L KNO3的處理菲約果的人工種子，與用蒸餾水處理的相比提高81.2 %,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,五、人工種子的儲存和萌發(fā),上海海

47、洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,貯藏,因農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的季節(jié)性所限，需要人工種子能貯藏一定時(shí)間但人工種子含水量大，常溫下易萌發(fā)，易失水干縮，貯藏難度較大人工種子研究中的主要難點(diǎn)之一,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,人工種子的儲藏技術(shù)很大程度上依賴于包被技術(shù)，不同的包被材料的儲藏方法也不同以海藻酸鈉為包被材料制作的人工種子為例，介紹人工種子的儲藏技術(shù),上海海洋大學(xué)

48、細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,1.低溫儲藏技術(shù),在不傷害植物繁殖體的前提下，通過降低溫度來降低繁殖體的呼吸作用，使之進(jìn)入休眠狀態(tài)常用的溫度一般是4 ℃儲藏時(shí)間可達(dá)1-2個月,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,泡桐的人工種子4 ℃保存,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,非體細(xì)胞胚人工種子可以在4℃下儲藏更長的時(shí)間,1999年，包被

49、瀕危植物地寶蘭的類原球體，儲藏120 d后生存能力與儲藏前相比無明顯變化馬鈴薯芽尖用海藻酸鈉包被， 儲藏270 d、360 d和390 d后 萌發(fā)率分別是100 %、70.8%和25%,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,隨著低溫儲存時(shí)間的加長，包被體系內(nèi)的含氧量降低，人工種子萌發(fā)率會

50、下降,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,2.液體石蠟儲藏技術(shù),液體石蠟作為經(jīng)濟(jì)、無毒穩(wěn)定的液體物質(zhì)，常被用來儲藏細(xì)菌、真菌和植物愈傷組織研究胡蘿卜人工種子的結(jié)果表明短時(shí)間保存（1個月）能較正常的生長長時(shí)間 （79 d），則人工種子苗的生長則明顯比對照組差并發(fā)現(xiàn)液體石蠟對幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻礙作用，達(dá)不到所需的效果,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.c

51、n,3.超低溫儲藏技術(shù),超低溫一般是指-80 ℃以下的低溫超低溫冰箱（ -80 ℃- -150 ℃ ）液氮（ -196 ℃ ）在此溫度下，植物活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生命活動幾乎完全停止所以，植物繁殖體在超低溫過程中不會引起遺傳性狀的改變，也不會丟失形態(tài)發(fā)生的潛能,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,目前應(yīng)用于人工種子超低溫保存的方法主要是預(yù)培養(yǎng)-干燥法即人工種子經(jīng)一定的預(yù)處理，并進(jìn)行干燥，然后

52、浸入液氮保存經(jīng)液氮儲藏后，可直接在室溫下自然解凍,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,1999年，將蛇麻草離體培養(yǎng)獲得的芽尖干燥脫水，經(jīng)液氮儲藏后，室溫下解凍5 min，恢復(fù)率可達(dá)80％，且無表型變異現(xiàn)象,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,4.植物激素在儲存中的作用,脫落酸(ABA)是一種植物逆境激素，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白質(zhì)、多胺、脯氨酸和淀粉等物質(zhì)的增加，使體細(xì)胞

53、胚在干燥處理中受到保護(hù),上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,Nieves等(2001) 對甘蔗晚盾片期胚用ABA或JA（茉莉酸）處理后進(jìn)行包被，并在干燥器中用無水硅酸進(jìn)行干燥處理，使其水含量降至60％或30％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)存活的體細(xì)胞胚是由ABA處理的胚，而用JA處理不能達(dá)到此效果,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,抑制植物生長、萌發(fā)、促進(jìn)衰老、提高抗性等生理作.,

54、對于非體細(xì)胞胚人工種子，Khor 等(1998) 對龍舌蘭(Spathoglottis plicata)原球莖用l0-5 M 的ABA處理，經(jīng)干燥脫水與包埋，也可獲得極高的存活率。,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,高滲透壓處理可增加植物繁殖體內(nèi)源ABA濃度、誘導(dǎo)休眠，從而增加其耐旱性,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,榆葉梧桐(Guazuma crinita

55、)的不定芽經(jīng)25%的甘油，15 %蔗糖，15 %的乙烯基乙二醇，13 %的二甲基亞砜和2 % 的聚乙二醇(4 000)溶液(w/v)在25℃處理15-60min后儲存在液氮中，可得到80 %的存活率,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,防腐,人工種子大面積田間應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)之一人工胚乳中含有糖類等有機(jī)物質(zhì)目前尚未得到可真正稱為人工種皮的包裹材料暴露于田間的開放系統(tǒng)中，勢必會受微生物的侵染而腐爛

56、在人工種皮中添加一定量的抗生素或防腐劑等能起抑菌作用，萌發(fā)率可提高 4-10%,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,人工種子技術(shù)展望及存在的 問題,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,目前，科學(xué)工作者已制成模式性人工種子的植物十余種，但距離實(shí)際應(yīng)用還有很大距離,上海海洋大學(xué) 細(xì)胞工程 黃林彬 lbhuang@shou.edu.cn,主要有三大難題有待克服①許多重要