第六課題魚卵的形態(tài)學(xué)-卵膜掃描電鏡觀察及遺傳學(xué)鑒定的研究

1、魚卵的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)鑒別的研究,張秀梅 高天翔 卞曉東 肖永雙,2007.5.25,魚卵鑒別的重要意義,環(huán)境影響的評(píng)估,魚類的增殖,漁業(yè)資源的解析,魚類的放流,魚類的養(yǎng)殖,,,海洋生態(tài)系統(tǒng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)工作,目的意義,,魚卵的鑒別的方法,,(Shao et al.,2002),研究背景,魚卵的形態(tài)學(xué)鑒別,研究背景,,19世紀(jì)，80～90年代漁業(yè)生產(chǎn)迅速發(fā)展（英國(guó) Holt&Mintoch, 德國(guó) Ehrorba

2、um，法國(guó)的 Guitel）開始魚卵、仔魚的種類鑒別。二戰(zhàn)后，因各國(guó)傳統(tǒng)漁場(chǎng)普遍過渡捕撈，資源瀕臨枯竭，所以用魚卵魚、仔稚魚的調(diào)查資料來估算魚類資源量。（日本的水戶敏，沖山宗雄。美國(guó)的Ahlstrom Matarese&Sandknop等）。我國(guó)的學(xué)者在上世紀(jì)五、六十年代也對(duì)中國(guó)近海的主要魚卵、仔魚種類的形態(tài)學(xué)研究做了部分研究工作。(陳真然，張孝威，沙學(xué)紳，何桂芬，張仁齋等)。,迄今為止，絕大多數(shù)魚卵種類的鑒定主要是依靠形態(tài)

3、學(xué)觀察的方法，依據(jù)人工孵化或是連續(xù)觀測(cè)的方法獲得的圖鑒和檢索表來進(jìn)行魚卵種類的鑒別。,魚卵的形態(tài)學(xué)鑒別要點(diǎn),,,,研究背景,獨(dú)立于胚胎的外部特征魚卵的形狀、大小，卵殼的形狀，卵黃的形狀，油球的有無，以及圍卵腔的大小，卵膜絲的有無。,與胚胎發(fā)育相關(guān)的特征如色素的分布，肌節(jié)的數(shù)目，消化道的長(zhǎng)短，魚鰭折疊的類型，心臟的位置，在不同發(fā)育階段胚孔關(guān)閉以及孵化程度，發(fā)育后期以及新孵化仔魚的卵黃囊的形狀，油球在卵黃囊中的分布狀態(tài)等,魚卵的形態(tài)

4、學(xué)研究的特點(diǎn),研究的背景,魚卵階段發(fā)育時(shí)間短，形態(tài)變化復(fù)雜，鑒別的形態(tài)特征較少。,許多魚類的產(chǎn)卵期與產(chǎn)卵區(qū)相互交疊,卵的形態(tài)也特別地相似。,要求鑒別者要有較高的魚類分類學(xué)知識(shí)積累。,鑒別工作需要消耗大量的時(shí)間。,目前已鑒別的魚卵仔稚魚種類（Shao et al,2002）,成魚種類2.7萬種（2002）,世界上目前已鑒別的成魚種類已愈2萬7千余種，而鑒別的仔稚魚數(shù)目為成魚種類的1/10,鑒別的魚卵數(shù)目又僅為已鑒別仔稚魚數(shù)目的1/10。我

5、國(guó)海洋魚類3023種。硬骨魚類2786種，有資料可查的魚卵、仔魚種類不過150種。,研究背景,卵膜掃描電鏡觀測(cè),研究背景,不同魚類卵膜的超顯微結(jié)構(gòu)不盡相同，卵膜表面的許多形態(tài)結(jié)構(gòu)可以作為區(qū)分魚類科或?qū)俚男誀?，而在受精?區(qū))結(jié)構(gòu)中可找到種的特征（ Gary et al., 1982 ）。,近30年來，已有不少學(xué)者利用掃描電鏡對(duì)魚卵卵膜進(jìn)行亞（超）顯微結(jié)構(gòu)觀察。以期 發(fā)現(xiàn)魚卵更多的形態(tài)學(xué)鑒別的結(jié)構(gòu)特征。,Sparus sarba（黑鯛）,

6、精孔管壁類型1.螺線形（鲀科、牙鲆、黑鯛）2.肋條狀（鮭屬Salmonid魚卵）3.階梯狀（尼羅羅非魚）,魚卵卵膜受精孔的類型,Fugu obscurus（暗紋東方鲀）(3,1）,無凹陷，長(zhǎng)的孔道；螺線形,,魚卵的受精孔分為三種類型（Riehl & Götting,1 974) 1．深的凹陷和短的孔道。 2．淺的凹陷和長(zhǎng)的孔道。 3．只有一孔道，無明顯的凹陷。,Sparus sarba（

7、黑鯛）,淺的凹陷和長(zhǎng)的孔道,螺線形,淺的凹陷和長(zhǎng)的孔道,螺線形,深的凹陷和短的孔道,階梯狀,魚卵的遺傳學(xué)鑒別研究,mtDNA由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，嚴(yán)格的母系遺傳，比核基因進(jìn)化速度快，不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異，允許選擇不同的區(qū)域進(jìn)行不同時(shí)間尺度的進(jìn)化分析，即便是在最初的發(fā)育階段，在魚卵中也有大量mtDNA的拷貝數(shù)，因此，mtDNA是鑒別魚卵種類的首選分子標(biāo)記。,mtDNA序列分析是鑒別魚卵種類的有效方法之一，可以用mtDNA序列分析和形態(tài)學(xué)鑒

8、別結(jié)果來相互驗(yàn)證。,,迄今，國(guó)內(nèi)尚未見用mtDNA序列鑒別魚卵、仔稚魚的報(bào)道。,研究背景,國(guó)外研究進(jìn)展（簡(jiǎn)略）,Mork et al.（1983）、Graves et al.（1988）分別用同工酶分析的方法來鑒別魚卵與仔魚。Daniel Ⅲ and Graves（1994）用限制性酶切技術(shù)來鑒別春季產(chǎn)卵的石首魚科的魚卵。Rocha-Olivares（1998）用擴(kuò)增mtDNA特定區(qū)域的方法來鑒別巖礁魚類的魚卵與仔魚。近年來，操作簡(jiǎn)

9、便、結(jié)果直觀的測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用。Shao et al. （2002）用mtDNA的D-loop基因片段序列來鑒別臺(tái)灣海域的魚卵，指出只有靠基因序列的比對(duì)才能將魚卵準(zhǔn)確鑒別到種。Perez et al. （2005）用mtDNA中的16S rRNA序列來鑒別經(jīng)福爾馬林保存的Merluccius merluccius、Lepidorhombus boscii及L. whiffiagonis魚卵。García-Vá

10、zquez et al. （2006）利用16S rRNA為分子標(biāo)記來鑒別資源調(diào)查時(shí)采集的不同種類的魚卵。Pegg et al.（2006）利用線粒體DNA條形編碼來鑒別澳大利亞南部大堡礁海域的仔魚。,研究背景,,,,,DNA條形編碼（DNA barcoding）是對(duì)一個(gè)統(tǒng)一的目標(biāo)基因DNA序列的分析，達(dá)到物種鑒定分類的目的。目前國(guó)際上常用的為mtDNA上的16sRNA基因和COⅠ基因。,沙氏下鱵魚魚卵的形態(tài)學(xué)遺傳學(xué)鑒別研究,為了準(zhǔn)確

11、鑒別在南黃海海區(qū)（33°49′N, 122°10′E）利用淺水Ⅰ型浮游生物拖網(wǎng)采集的大量附著在海藻上的魚卵種類，利用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和遺傳學(xué)方法對(duì)其開展了綜合鑒別研究。,(Hyporhamphus sajori),其常棲息于淺海、河口，有時(shí)入淡水。主要分布在西北太平洋，從中國(guó)的長(zhǎng)江口起，到黃海，渤海，日本海，日本太平洋沿岸一直延伸到庫(kù)頁(yè)島以及符拉迪沃斯托克港灣附近。在黃渤海海域該魚于5月下旬到6月上旬產(chǎn)卵，其與頜

12、針魚科魚的產(chǎn)卵 期與產(chǎn)卵區(qū)相互交疊，卵的形態(tài)也特別的相似為黃渤海魚卵常見種類 。,沙氏下鱵魚的生態(tài)分布,1.形態(tài)學(xué)觀測(cè)（1）（4x10）,,1.魚卵透明，呈微扁圓形，粘著沉性，卵黃間隙狹小，卵徑多在20mm～25mm；,2.多油球數(shù)不定（>20），油徑變化大，在0.10～0.18mm之間，在卵黃囊后位聚集分布，且隨著胚胎發(fā)育，其位置也會(huì)發(fā)生很大的變化；卵黃較多，卵黃囊無龜裂，呈乳白色。,,3.卵膜較厚并具有較強(qiáng)的韌性，在上面著生有

13、4～7根細(xì)長(zhǎng)的角質(zhì)管狀卵膜絲，多為一端著生4根，另一端著生1根，卵藉此細(xì)絲彼此纏繞在一起并纏繞在其他物體或海藻上進(jìn)行發(fā)育。,形態(tài)學(xué)觀測(cè)（2）（4x10）,,4.該卵的卵裂和其它硬骨魚類相同,均屬盤狀分裂性，當(dāng)胚盤包卵3/4時(shí)，整個(gè)胚體即完全成形。,結(jié)論,魚卵與同期在該調(diào)查海域產(chǎn)附著性魚卵的種類，如頜針魚目（Beloniformes）頜針魚科（Belonidae）的扁頜針魚（Ablennes anastomella）、鱵科（Hemirha

14、mphidae）的沙氏下鱵魚、飛魚科（Exocoetidae）的燕鰩魚(Cypselurus agoo)，以及鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科(Tetraodontidae)魚類的卵相似。,,魚卵卵徑大，在2.0~2.5mm之間，而鲀科魚類所產(chǎn)卵的卵徑較小，一般在0.85~1.1mm之間。,魚卵卵膜表面動(dòng)物極端著生4根卵膜絲，在相反方向有1～2根卵膜絲，與扁頜針魚及沙氏下鱵魚相似，而燕鰩魚則具有30～40根。魚卵多油球、

15、數(shù)不定，與沙氏下鱵魚卵相似而扁顎針魚卵不含油球（萬瑞景, 姜言偉, 2000）。,且同一團(tuán)海草上采集到的魚卵處在不同的發(fā)育期，與陳大剛描述的沙氏下鱵魚為分批產(chǎn)卵類型相吻合。由此根據(jù)魚卵形態(tài)及生態(tài)特征初步推斷其為沙氏下鱵魚卵。,2.魚卵卵膜的掃描電鏡觀測(cè)（1）,魚卵受精孔明顯，為淺凹陷、長(zhǎng)孔道類型。 受精孔呈漏斗狀(圖3)，由受精孔前庭與精孔管組成。前庭上口緣直徑為12.3μm，下口徑7.3μm。,,魚卵卵膜上的微孔不明顯。魚卵卵膜表面出

16、現(xiàn)大量規(guī)則的顆粒狀突起。密度約為50個(gè)/100μm2，直徑在1.95～2.50μm之間。為該種魚卵表面的特異性結(jié)構(gòu)，可以作為該種魚卵種類鑒別的重要依據(jù)。,魚卵卵膜的掃描電鏡觀測(cè)（2）,卵膜表面還生有細(xì)長(zhǎng)管狀角質(zhì)細(xì)絲，在動(dòng)物極端著生4根，其基部較粗，有明顯的起訖點(diǎn)，基部斷裂面外管徑為34.0μm，且卵膜絲管與卵內(nèi)環(huán)境是相通的。,,通過對(duì)卵膜破裂卵的卵黃囊表面觀察發(fā)現(xiàn)，其存在規(guī)整的顆粒狀結(jié)構(gòu)。,小結(jié)：由于可供參考的資料不足，無法依據(jù)所得的結(jié)

17、果將魚卵鑒別到種。,3.魚卵遺傳學(xué)鑒別研究,,,,1. Cyt b基因不僅容易用一些通用引物擴(kuò)增和測(cè)序，而且它還是線粒體DNA上唯一的結(jié)構(gòu)和功能被了解的較為清楚的蛋白編碼基因 ，所以，與其它許多脊椎動(dòng)物一樣，在魚類中Cyt b基因也是分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用得較多的分子標(biāo)記。,,3.D-loop序列片段以其較高的突變積累對(duì)于研究物種內(nèi)的遺傳分化具有重要價(jià)值，已成為研究魚類種內(nèi)基因分化最常用的標(biāo)記。,,,2.COI基因?yàn)楠?dú)立于核基因組以外的環(huán)

18、狀DNA，進(jìn)化速度快，包含從種內(nèi)到種間的遺傳進(jìn)化信息, 可用于比較生物體進(jìn)化之間的相互關(guān)系。,,實(shí)驗(yàn)引物,用于擴(kuò)增D-loop基因的引物： L15623（5′-CCACCACTAGCTCCCAAAGC-3′） H16174（5′-GAACCTGACGAAGGAACCAGA-3′）,用于擴(kuò)增Cyt b基因片段的引物為： L14734-Glu（ 5′-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3′）

19、 H15149-Cyt b（5′-CTCAGAATGACATTTG TCCTCA-3′）,用于擴(kuò)增COI 基因序列的引物為： L5956-COI（5′-CACAAAGCATTGGCACCT-3′） H6558-COI（5′-CCTCCTGCAGGGTCAAGAA-3′）,序列用DNAStar軟件包進(jìn)行拼接、比對(duì)，用MEGA (Ver3.1)軟件分析.,比對(duì)分析所用的序列種類、拉丁名、英文名、中文名、樣

20、品來源以及處理方法,,,,,,,將測(cè)序所得的Cyt b基因片段序列輸入GenBank后，得到的同源序列,1.魚卵Cyt b基因片段序列與其它頜針魚目魚類同源序列變異位點(diǎn)圖譜,,,,,魚卵序列之間，以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間堿基無差異。,,,魚卵與太平洋頜針魚基因片段序列S.a1、S.a2、labS.a之間分別出現(xiàn)48、49、49個(gè)堿基差異，差異率在20.42～20.85%之間。,,魚卵與臺(tái)灣原尾頜針魚（Strongylura leiu

21、ra）基因序列片段S.l1、S.l2之間分別出現(xiàn)44個(gè)堿基差異，差異率為18.72%。魚卵與叉尾頜針魚（Tylosurus acus melanotus）基因序列片段T.a.m1、T.a.m2之間分別出現(xiàn)50、48個(gè)堿基差異，差異率在20.43～21.3％之間。,基于Cyt b基因構(gòu)建的魚卵及同源序列和遺傳距離圖,,,,,魚卵之間，以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間無差異。魚卵與其它頜針魚科魚類序列之間的遺傳距離符合Cyt b基因序列的遺傳

22、距離在10%以上時(shí)就具有種的差異的結(jié)果且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出一般種內(nèi)和亞種間的范圍。,,據(jù)其他一些動(dòng)物的Cyt b基因序列分析的結(jié)果，種內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離一般在0～4.06％之間，差異超過6%的個(gè)體已有明顯的亞種或種的分化。,魚卵之間以及魚卵與沙氏下鱵魚序列之間Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離為0。,魚卵與其它頜針魚目魚類序列間遺傳距離在21.9～26.4％之間,基于Cyt b基因構(gòu)建的魚卵及同源序列NJ系統(tǒng)樹,,且基于Cyt b基因構(gòu)建的NJ

23、分子系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示魚卵與沙氏下鱵魚序列聚為一支，親緣關(guān)系較近，而與其它頜針魚目魚類序列聚為兩支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。,2.魚卵與沙氏下鱵魚及太平洋頜針魚COⅠ基因片段序列比對(duì)分析,魚卵與沙氏下鱵魚及太平洋頜針魚COⅠ基因片段序列變異位點(diǎn)圖,,,,在所有566bp COⅠ基因片段序列中，魚卵與沙氏下鱵魚間僅出現(xiàn)了3個(gè)核苷酸替代，而魚卵與太平洋頜針魚COⅠ序列間出現(xiàn)了111個(gè)堿基替代,,,,基于COⅠ基因片段序列的遺傳距離，NJ分子系統(tǒng)樹、以

24、及核苷酸組成,,,魚卵與沙氏下鱵魚序列片段間遺傳距離在0～0.4%之間，應(yīng)為種內(nèi)水平差異，而與太平洋頜針魚之間為23.1％左右，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了種類水平的差異,,,3.用D-loop片段序列的驗(yàn)證,,,,魚卵與沙氏下鱵魚D-loop序列片段之間僅出現(xiàn)3個(gè)堿基替代,結(jié)論,魚卵與沙氏下鱵魚基于D-loop基因序列的平均遺傳距離,,,,遺傳距離在0～0.7%之間，也為物種內(nèi)水平的遺傳分化。,小結(jié)：魚卵與沙氏下鱵魚Cyt b與COⅠ基因片段序列間

25、的遺傳距離均為種內(nèi)水平的遺傳變異。而與頜針魚科魚類基因片段序列間的遺傳距離。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了物種水平差異。且通過Cyt b與COⅠ基因片段序列的NJ分子系統(tǒng)樹結(jié)果顯示，魚卵與沙氏下鱵魚聚為一支，它們之間親緣關(guān)系較近，而與頜針魚科魚類分聚為兩支，它們之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。用D-loop片段序列進(jìn)行驗(yàn)證，得到了相同的結(jié)果。遺傳學(xué)結(jié)果顯示魚卵為沙氏下鱵魚卵,總結(jié),,雖然運(yùn)用掃描電鏡能夠發(fā)現(xiàn)較多的魚卵鑒別特征，但由于到目前為止真正利用掃描電鏡觀察來

26、鑒別魚卵種類的報(bào)道較少，可供參考的資料不足。,,目前形態(tài)學(xué)的方法雖然只能將魚卵鑒定到科或?qū)俚乃?，但其還是鑒定魚卵的手段，且在進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定前，也應(yīng)當(dāng)以形態(tài)學(xué)鑒定的初步結(jié)果為前提來選擇魚卵所屬的科或?qū)俚某婶~來進(jìn)行比對(duì)分析。,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)也呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，越來越多的魚類基因片段序列被測(cè)序，今后可運(yùn)用GenBank中豐富的資源，將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)直接運(yùn)用到魚卵與仔稚魚的準(zhǔn)確鑒別中，提高魚卵鑒別的準(zhǔn)確度。

27、我們也注意到，要運(yùn)用遺傳學(xué)方法，雖然技術(shù)手段已經(jīng)比較成熟，但是我們需要建立龐大的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)來記錄各種魚類的基因片段序列，這需要花費(fèi)大量的時(shí)間跟財(cái)力。目前，盡管國(guó)際上對(duì)用線粒體DNA條形編碼鑒別物種尚存爭(zhēng)論，但它操作的簡(jiǎn)便性和高效性將以我們無法想象的速度加快物種鑒定和進(jìn)化歷史研究的步伐。DNA條形編碼是生物分類的大勢(shì)所趨，已成為生物分類學(xué)中引人注目的新方向（Ward et al., 2005; Schander & Wil