rt-pcr(經(jīng)驗)

1、RTPCR實驗步驟一、組織一、組織RNARNA的提取的提取1.方法取100mg左右的組織，按說明書提取總RNA。2.小心棄去乙醇后，室溫干燥沉淀25min，加入適量的RNasefree水（100μl）溶解沉淀，可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA完全溶解后于80℃保存。3.注意：關(guān)鍵是要抑制細胞中的RNA酶和防止器材及試劑中的RNA酶污染。器具最好專門使用，盡量使用一次性塑料器皿。(1)使用玻璃器皿按下列方法處理①用0.1%DEPC水處理1

2、2小時②120℃高壓滅菌30min以除去殘留的DEPC。(2)試劑配制①用于RNA實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或使用DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（或一次性塑料容器）。②RNasefree水：使用RNasefree玻璃瓶，向超純水中加入DEPC至終濃度0.1%（VV），過夜攪拌后，高溫高壓滅菌。二、紫外檢測提取的二、紫外檢測提取的RNARNA(1)測定步驟2的RNA溶液的R值（OD260OD280）。質(zhì)量較好的

3、RNA的R值應(yīng)在1.82.2之間，R2.2，說明RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。(2)260nm、320nm、230nm、280nm的OD值分別代表了核酸、背景（溶液混濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機物的吸光度值。(3)DNA和RNA模板濃度檢測：此為估計值，應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果比對。DNA濃度（μgml）=A26050(常數(shù))稀釋倍數(shù)RNA濃度（μgml）=A26040(常數(shù))稀釋倍數(shù)三、引物合成三、引物合成1.根據(jù)基因序列設(shè)計引物（

4、每個基因為1對引物）。上海生工合成的引物包裝為1OD260管，報告單有使用引物的常用參數(shù)。根據(jù)說明先配成100μM的貯存液，使用前稀釋成20μM。20℃以下保存。四、四、RTPCRRTPCR（TaKaRaTaKaRa試劑）試劑）1.配制RTPCR反應(yīng)液（50μl）Prime1StepEnzymeMix2μl21StepBμffer25μl上游Primer(20μM)11μl下游Primer(20μM)21μlTemplateRNA(Po

5、sitiveControlRNA)Xμl3RNaseFreeDH2OUpto50μl1PositiveControlRNA時使用F1Primer2PositiveControlRNA時使用R1Primer3TotalRNA的使用量建議在1μg（約5μl）以下。2.RTPCR反應(yīng)條件設(shè)置按說明書操作。3StepPCR反應(yīng)時50℃30minRT反應(yīng)94℃2minRTase失活94℃30sec5565℃30sec72℃1minkbp五、電泳五

6、、電泳1.瓊脂糖（Agarose）凝膠濃度：根據(jù)擴增產(chǎn)物片斷大小選擇。2.Marker用量：50bpDNAMarker共16條帶，其中300bp、600bp的DNA片斷顯示亮帶。電泳時的加樣孔寬度小于6mm時，取5μl即可。3.GelGreen或GelRed：①膠染法：50ml瓊脂糖溶液中加入5μl（10000儲存液）②泡染法：制成3染液（如15μl10000儲存液5ml1MNacl45mlH20），室溫振蕩染色30min。4.1.0g