dna提取及pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、PCR擴(kuò)增及DNA瓊脂糖凝膠電泳劉琳1131428環(huán)境科學(xué)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握PCR擴(kuò)增的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2對(duì)擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并分析相應(yīng)結(jié)果。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1.PCR擴(kuò)增多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程。在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA、四種脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱Taq聚合酶及兩個(gè)合成DNA的引物，而后加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變

2、性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（55℃）與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在Tap酶作用下，用四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫退火和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并在重復(fù)過(guò)程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與

3、DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按指數(shù)方式擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)30～40個(gè)循環(huán)，DNA擴(kuò)增即可完成。2.DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混

4、合物的目的。三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料儀器：PCR擴(kuò)增儀、0.2ul薄壁管、1.5ml離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、兩種引物、16S全長(zhǎng)DNA樣本、無(wú)菌ddH2O、模板DNA、TBE、瓊脂糖、EB、顯色劑。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1.PCR擴(kuò)增本次試驗(yàn)選擇細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。1.1根據(jù)計(jì)算，首先取1.5ml離心管按照2.5ul10B

5、uffer、1uldNTP、0.5ul341GC、0.5ul534、0.125ulTaq、19.375uddH2O的比例配置足量的PCR反應(yīng)體系。1.2分別向9個(gè)薄壁管中分別加入24ul的反應(yīng)體系，并分別添加8種不同的模版，并于第9個(gè)薄壁管中加入無(wú)菌ddH2O作為陰性對(duì)照。1.3將薄壁管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照預(yù)定程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中循環(huán)過(guò)程需要達(dá)到30~40次。程序如下：預(yù)變性：94℃3min循環(huán)：94℃變性30s55℃退火30s

6、72℃延伸30s末次延伸：72℃5min七、實(shí)驗(yàn)收獲七、實(shí)驗(yàn)收獲1.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握了PCR反應(yīng)的基本原理、實(shí)驗(yàn)過(guò)程及技術(shù)。2.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)掌握了電泳實(shí)驗(yàn)分離DNA的原理和方法。八、思考題八、思考題1、如果你的研究中要擴(kuò)增大腸桿菌某個(gè)酶的基因，你如何進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)？通過(guò)PCR擴(kuò)增出想要的片段，然后通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回收，并與合適的載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切或PCR驗(yàn)證，測(cè)序最終驗(yàn)證，保存菌種2.一對(duì)引物

7、序列為5‘GACTCCAGTCGAATCTACCA3’和5‘AACCGTGGCGACACCGCTAA請(qǐng)計(jì)算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你算的退火溫度做PCR時(shí)沒(méi)有得到相應(yīng)的產(chǎn)物，你怎么解決？5‘GACTCCAGTCGAATCTACCA3’Tm值=4（GC）2(AT)(5～10℃)=4（37）2（64）(5～10℃)=60℃(5～10℃)=50~55℃5‘AACCGTGGCGACACCGCTAA’Tm值=4（GC）2(AT)(

8、5～10℃)=4(57)2(62)(5～10℃)=64℃(5～10℃)=54~59℃因此退火溫度可以選擇在55℃可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)令引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)