含量測定技術(shù)

1、第六章 中藥制劑的含量測定,概 述一、含量測定的定義和意義 用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法或儀器分析方法對(duì)制劑中某種（些）有效成分或指標(biāo)性成分進(jìn)行的定量分析。 意義：判斷藥品的優(yōu)劣，是控制和評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量的重要方法。,二、含量測定方法 包括 由于中藥制劑組成復(fù)雜，儀器分析法更為常用。 《中國藥典》中藥制劑含量測定方法

2、概況見下表。,,化學(xué)分析法,儀器分析法,第二節(jié) 可見-紫外分光光度法,鑒別用于 檢查 含量測定,,一、概述 1、定義 根據(jù)被測物質(zhì)在可見-紫外光的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的方法稱可見-紫外分光光度法。,,,2、特點(diǎn) 操作簡便，靈敏度高，常用于中成藥含測。但本法不具分離功能，常用于總成分的測定。,3 、含量測

3、定方法 對(duì)照品比較法、吸收系數(shù)法、比色法,4、定量分析的理論基礎(chǔ) 朗伯-比爾定律 A = K C L A----吸光度 K----吸收系數(shù) C----溶液濃度 L----溶液厚度,百分吸收系數(shù)：E 藥典采用摩爾吸收系數(shù)：,∈,,

4、K,1%1cm,二、儀器,紫外-可見分光光度計(jì),工作波長范圍：190~900nm,組成,光源單色器吸收池檢測器信號(hào)顯示處理系統(tǒng),,紫外分光光度計(jì)工作原理,1—?dú)錈簦?—凹面聚光鏡；3—鎢燈；4—吸收池；5—紫敏光電管；6—紅敏光電管7—光電管調(diào)動(dòng)推桿；8—暗電流控制閘門拉桿；9—吸收池架；10—濾光片架拉桿11—平面鏡；12—入射狹縫及石英窗；13—球面準(zhǔn)直鏡；14—石英棱鏡；15—出射狹縫；16—石英透鏡,1、光源

5、 氫燈或氘燈：紫外光區(qū) 鎢燈或鹵鎢燈：可見光區(qū) 2、單色器 狹縫、棱鏡、光柵 3、吸收池 石英吸收池：紫外、可見光區(qū) 玻璃吸收池：可見光區(qū) 4、檢測器 光電管、光電倍增管等 5、信號(hào)顯示處理系統(tǒng),三、操作方法（一）操作前的準(zhǔn)備

6、 紫外-可見分光光度計(jì)的校正 波長 汞燈、氘燈、鈥玻璃 吸光度 重鉻酸鉀的硫酸溶液 P186 雜散光 碘化鈉和亞硝酸鈉溶液 吸收池誤差（二）儀器操作通法,（三）樣品測定法,藥典收載了三種測定方法 1.吸收系數(shù)法 2.對(duì)照品比較法 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線法 （原計(jì)算分光光度法取消）,1.原理 配制一系列不同濃度（Ci）的對(duì)照品溶液

7、（5～7份），在相同條件下分別測其吸收度(Ai)，以A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制A-C曲線，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線（又稱工作曲線）。在相同條件下測定供試品的A,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出與之對(duì)應(yīng)的C，即可求出濃度和含量（圖6－3）。亦可將一系列對(duì)照品溶液的C與相應(yīng)的A進(jìn)行一元線性回歸，求出回歸方程（相關(guān)系r≥0.999），將供試品溶液的A代入回歸方程，算出被測成分的濃度和含量。,標(biāo)準(zhǔn)曲線,1、比色法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,2.特點(diǎn) 本法多用于可見分光光度法，

8、由于影響顯色反應(yīng)的因素多，有的儀器單色光純度較差，故測定時(shí)應(yīng)用對(duì)照品同時(shí)操作。本法適用于批量樣品的分析，當(dāng)儀器和測定條件固定時(shí)，曲線可多次使用。 3.應(yīng)用 主要用于總成分的測定。例如《中國藥典》槐米中的蘆丁、復(fù)方皂礬丸中的硫酸亞鐵、獨(dú)一味膠囊、益心酮片、消咳喘糖漿和排石顆粒中的總黃酮、桂林西瓜霜中總生物堿的含量測定。,二、對(duì)照品比較法 1.原理 在相同條件下分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，在規(guī)定波長處測定試

9、品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度后，按下式計(jì)算供試品溶液的濃度： C供(g/ml)=（A供/A對(duì)）C對(duì) C供為供試品溶液的濃度；A供為供試品溶液的吸光度；C對(duì)為對(duì)照品溶液 的濃度；A對(duì)對(duì)照品溶液的吸光度。,,2.特點(diǎn) 對(duì)照品溶液與供試品溶液的濃度應(yīng)盡可能接近，一般要求對(duì)照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的100%&#

10、177;10%。 3.應(yīng)用實(shí)例 《中國藥典》華山參片中總生物堿、黃楊寧片中黃楊寧的含量測定等均采用本法。,3、吸收系數(shù)法原理 C 為供試液濃度（g/100ml） A 為供試液測得的吸收度 E 為被測物質(zhì)的百分吸收系數(shù)（藥典給出） L 為比色皿（液層）厚度（1cm）特點(diǎn)

11、 不需對(duì)照品隨行測定，操作簡便，僅用于紫外分光光度法。 故需嚴(yán)格校正儀器，規(guī)范實(shí)驗(yàn)條件，做好前處理工作。,,1cm,,1%,1%,E L,1%,四、注意事項(xiàng),1、使用的吸收池必須潔凈，并注意配對(duì)。2、取吸收池時(shí)，手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)。3、供試液的濃度：A=0.3~0.74、對(duì)溶劑的要求 A盡量小，空白對(duì)照 測定波長確證 ±2nm5、平行操作6、狹縫

12、寬度五、記錄與計(jì)算六、結(jié)果判斷,七.實(shí)例 1、黃楊寧片中黃楊寧的含量測定 本品為黃楊寧經(jīng)加工制成的片劑。 每片含環(huán)維黃楊星D 0.5mg或1mg。 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的環(huán)維黃楊星D對(duì)照品25mg，置250ml量瓶中，加甲醇70ml使溶解,用 0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液稀釋至刻度，搖 勻，精密量取10ml，置100ml量瓶中， 用 0.05mol

13、/L磷酸二氫鈉緩沖液稀釋 至刻度，搖勻，即得。 （每1ml含環(huán)維黃楊星D10μg）,環(huán)維黃楊星D,供試品溶液的制備 取本品20片（每片含環(huán)維黃楊星D0.5mg ），精密稱定（2.050g），研細(xì)，精密稱取0.1020g（約相當(dāng)于黃楊0.5mg），置50ml量瓶中，加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至近刻度，80℃水浴恒溫1.5小時(shí)后取出，冷卻至室溫,加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至刻度，搖勻，離心6分鐘（每分

14、鐘轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)），取上清液，即得。,測定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5ml,分別置分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚藍(lán)溶液（取溴麝香草酚藍(lán)18mg，置250ml量瓶中，加甲醇5ml使溶解，加0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖液至刻度，搖勻，即得）5ml，搖勻，立即分別精密加入氯仿10ml，振搖2分鐘，靜置1.5小時(shí)，分取氯仿層，置含0.5g無水硫酸鈉的具塞試管中，振搖，靜置，取上清液，照分光光度法（附錄Ⅴ A），在410nm

15、的波長處分別測定吸收度（ A對(duì)＝ 0.454 A供＝0.445），計(jì)算，即得。 本品每片含黃楊寧以環(huán)維黃楊星D(C26H46N2O)計(jì)，應(yīng)為標(biāo)示量90.0%～110.0％。,2、前列舒丸（水蜜丸）中牡丹皮的含量測定,取本品切碎，取2g，精密稱定（2.135g）；用水蒸氣蒸餾，收集餾出液約450ml,置 500ml量瓶中，加水稀釋至刻度，照分光光度法（附錄Ⅴ A）在274nm 的波長處測定吸收度（A=0.333），按丹皮

16、酚（C9H10O3 ）吸收系數(shù)（Ｅ ）為862 計(jì)算，即得。本品含牡丹皮按丹皮酚(C9H10O3) 計(jì)，每1g不得少于0.53mg,1cm,(1) 供試液濃度的計(jì)算 （2）牡丹皮含量計(jì)算,駐車丸（水丸）中總生物堿的含量測定 本品由黃連、炮姜、當(dāng)歸、阿膠等四味中藥制成。 取本品粉末（過三號(hào)篩）2g，精密稱定，置索氏提取器中，加鹽酸－甲醇(1:100) 的混合溶液適量，加熱回流至回流

17、提取液無色時(shí)為止，將提取液（必要時(shí)濃縮）移至50ml量瓶中，加鹽酸－甲醇(1:100) 的混合溶液至刻度，搖勻。照柱色譜法（附錄Ⅵ C）試驗(yàn)，精密量取5ml,置中性氧化鋁柱（5g，內(nèi)徑0.9cm,濕法裝柱，用乙醇30ml預(yù)洗）上，用乙醇25ml分次洗脫，收集洗脫液，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，精密量取2ml 置50ml量瓶中，加0.05mol／L硫酸溶液至刻度，搖勻，照分光光度法（附錄Ⅴ A），在345nm 的波長處測定吸收度

18、，按鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl)的吸收系數(shù)（Ｅ ）為728 計(jì)算，即得。 本品按干燥品計(jì)算，每1g含總生物堿以鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl計(jì)，不得少于 30.0mg。,實(shí)例,益心酮片總黃酮的含量測定 本品為山楂葉經(jīng)提取總黃酮制成的片劑。

19、 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25mg置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處 理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取 20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml含無水蘆丁0.20mg）。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，

20、使混勻，放置6分鐘。加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘；以相應(yīng)的溶液為空白。照分光光度法（中國藥典附錄V B），在500nm為波長處測定吸度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,測定法 取本品20片，除去包衣，精密稱定2.100g，研成細(xì)粉，精密稱取0.5315g（約相當(dāng)于5片的重量），精密加入稀乙醇25ml，密塞，搖勻，超聲處理5分鐘，靜置3小時(shí)以上，濾

21、過，精密量取濾液4ml，置50ml量瓶中，用水稀釋到刻度，搖勻，再精密量取2ml，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線置備項(xiàng)下的方法，自“加水至6ml”起，依法測定吸收度，A=0.3620，并取同樣量的供試品溶液，加水至25ml作空白。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算每片總黃酮含量（以無水蘆丁計(jì)）?！吨袊幍洹芬?guī)定本品每片含黃酮以無水蘆?。–27H30O16）計(jì)，不得少于25.0mg。,第三節(jié) 薄層掃描法--TLCS 一、概述

22、 1、定義 薄層掃描法（TLCS）系指用一定波長的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量分析的方法。,2、特點(diǎn) 具有分離分析雙重功能。 與高效液相色譜法比較，具有多通道效應(yīng)，可同時(shí)平行分離分析多個(gè)樣品；流動(dòng)相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對(duì)樣品的預(yù)處理

23、要求不高等優(yōu)點(diǎn)。 目前隨著制板、點(diǎn)樣、展開等操作的儀器化及儀器性能的改進(jìn)，該法檢測的靈敏度，結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度均大大提高，在中藥及其制劑檢驗(yàn)中，已成為重要的分析方法。《中國藥典》中有32個(gè)中成藥品種采用該法進(jìn)行含量測定。,瑞士CAMAG SCANNER 3 薄層掃描儀,島津CS-9000雙波長薄層掃描儀,二、儀器及其工作原理 1.薄層掃描儀 中國藥典采用雙波長薄層掃描儀。常用的有島津CS-930型和

24、CAMAG-Ⅱ型等。 2.掃描儀工作原理,三、操作方法,（一）操作前的準(zhǔn)備 1、對(duì)照液和供試液的制備 2、市售薄層板（二）操作通法 點(diǎn)樣→展開→上機(jī)掃描→數(shù)據(jù)處理 1、點(diǎn)樣 2、展開 3、上機(jī)掃描 檢測方法： （1）吸收法 （2）熒光法 測定方式： （1）反射法（常用）（2） 透射法

25、 掃描波長： （1）單波長 （2）雙波長（藥典采用） 掃描方式： （1）線形掃描 （2）鋸齒掃描（常用） 4、數(shù)據(jù)處理,測定方法 （1）吸收法 適用于有紫外（可見）吸收的成分，較常用。該法又可采用反射法或透射法測定。理論上講，透射法比反射法優(yōu)越，但實(shí)際工作中常用反射法，因?yàn)樽贤夤獠荒芡ㄟ^玻板。 （2）熒光法

26、 適用于有熒光性質(zhì)的成分，例如小檗堿等。該法僅采用反射法測定，其靈敏度比吸收法高。,測定波長 （1）單波長 一般用于熒光測定法，即用某一波長的紫外光（激發(fā)光）進(jìn)行掃描。對(duì)玻板和斑點(diǎn)的質(zhì)量要求較高。 （2）雙波長 主要用于吸收測定法。該法可消除背景干擾，對(duì)玻板和斑點(diǎn)的質(zhì)量要求不高，故較常用。測定時(shí)，樣品波長（λs）和參比波長（λR）依次掃描斑點(diǎn)，所測吸收度為ΔA=Aλs

27、－AλR 樣品波長（λs）：即被測成分的λmax 參比波長（λR）：即被測成分的λmin或此波長處無吸收。,光束掃描方式（1）直線掃描 適用于規(guī)則的斑點(diǎn)，僅用于熒光測定法。（2）鋸齒掃描 適用于不規(guī)則的斑點(diǎn)，測量誤差小，被測成分積分值重現(xiàn)性好，故吸收測定法常用此掃描方式。 6.光源（1）鎢燈（W） 供可見光（370～700nm）測定，掃

28、描有色成分的斑點(diǎn)。（2）氘燈（D2） 供紫外光（200～370nm）測定，掃描有紫外吸收的成分斑點(diǎn)。（3）氙燈（Xe） 供熒光測定，發(fā)射不連續(xù)光譜，常用波長為365nm。,四、含量測定方法（外標(biāo)法） TLCS含量測定有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，中國藥典僅采用外標(biāo)法。 1.原理 外標(biāo)法系將一定量的供試品溶液和對(duì)照品溶液分別點(diǎn)加在同一塊薄層板上，展開，顯色

29、，定位，掃描被測成分和對(duì)照品斑點(diǎn)，測得相應(yīng)的吸光度或熒光強(qiáng)度積分值，根據(jù)定量關(guān)系，計(jì)算出被測成分的含量。 2.類型 根據(jù)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線性質(zhì)的不同，外標(biāo)法又分為外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)法。 若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點(diǎn)，采用外標(biāo)一點(diǎn)法。 若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點(diǎn)，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法。,外標(biāo)一點(diǎn)法的直線方程： C = F A F 為斜率外標(biāo)兩點(diǎn)法的直線方程：,,,、,,,F1為斜率,F

30、2為截距,3.操作步驟（1）對(duì)照品溶液的制備（2）供試品溶液的制備（3）點(diǎn)樣 一般要求使用市售薄層板。 ①外標(biāo)一點(diǎn)法：至少6個(gè)原點(diǎn) 對(duì)照品（R）2個(gè)（同一質(zhì)量）：2R 供試品（S）4個(gè)（同一質(zhì)量）分2組：2S1 2S2,②外標(biāo)兩點(diǎn)法：至少8個(gè)原點(diǎn),對(duì)照品（R）4個(gè) 分2組 大質(zhì)量的2個(gè)：2R1

31、 小質(zhì)量的2個(gè)：2R2 供試品（S）4個(gè)（同一質(zhì)量）分2組： 2S1 2S2對(duì)照品與供試品應(yīng)交叉點(diǎn)加在同一塊薄層板上，目的在于消除各種誤差。測定時(shí)應(yīng)保證供試品原點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量。,外標(biāo)兩點(diǎn)法,外標(biāo)一點(diǎn)法,（4）展開（5）顯色定位 供試品色譜中待測斑點(diǎn)的比移值（Rf值）和光譜掃描得到的吸收光譜最大吸收與最小吸收應(yīng)與對(duì)照品相符，以保證測定結(jié)果的

32、準(zhǔn)確性。（6）掃描 應(yīng)沿展開方向掃描，不得橫向掃描。（7）含量計(jì)算 ①外標(biāo)一點(diǎn)法 ▲求出供試品被測成分（斑點(diǎn)）的質(zhì)量,Ms被測成分的質(zhì)量（M n=2）MR被測對(duì)照品的質(zhì)量As被測成分吸收度（熒光強(qiáng)度）積分值（A n=2）AR被測對(duì)照品吸收度（熒光強(qiáng)度）積分值（A n=2）,__,_,_,▲求出供試品中被測成分的含量,含量（W/W） =,,Ms X 稀釋倍數(shù),取樣量,含量（W/片） =,,Ms X 稀釋倍數(shù) X 平均

33、片重,取樣量,②外標(biāo)兩點(diǎn)法,▲求出供試品斑點(diǎn)中被測成分的質(zhì)量,Ms = ? C +V1C,,(V2-V1) (A-A1),(A2-A1),Ms被測成分的質(zhì)量（mg n=2） A1對(duì)照品小點(diǎn)樣量吸收度V1對(duì)照品小點(diǎn)樣量（μl） （熒光強(qiáng)度）積分值（A n=2 ） V2對(duì)照品大點(diǎn)樣量（ μl ） A2對(duì)照

34、品大點(diǎn)樣（熒光強(qiáng)度）A被測成分吸收度（熒光強(qiáng)度） 積分值（A n=2） 積分值（A n=2） C對(duì)照液的濃度（mg/ml）,-,-,-,__,五、應(yīng)用實(shí)例 1.九分散中士的寧的含量測定 九分散是由馬錢子粉、麻黃、乳香和沒藥等制成。馬錢子粉中含有士的寧、番木鱉堿等生物堿，具生理活性但也有毒性，故需控制馬錢子含量。中國藥典規(guī)定按

35、干燥品計(jì)每包含馬錢子以士的寧計(jì)應(yīng)為4.5～5.5mg。 供試品溶液的制備 取本品10包，混合研勻。精密稱取2g置具塞錐形瓶中，精密加氯仿20ml與濃氨試液1ml，輕輕搖勻，稱重，于室溫下放置24小時(shí)，再稱重，補(bǔ)足氯仿減失的重量，充分振搖，濾過。精密量取濾液10ml，用硫酸溶液（3→300）分次提取，至生物堿提盡，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加濃氨試液使呈堿性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，

36、放冷，殘?jiān)芯芗勇确?ml使溶解，作為供試品溶液。,對(duì)照品溶液的制備 取士的寧對(duì)照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。 測定法 吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液。（16∶12∶1∶4）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。照薄層色譜法進(jìn)行掃描，波長：λs=254nm ，λR=325nm ，測量供試品吸收

37、度積分值與對(duì)照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。已知：AR＝19663.07， As＝20617.25，取樣量2.098g。 解答問題 ①采用外標(biāo)一點(diǎn)法還是外標(biāo)兩點(diǎn)法？ ②采用什么方法顯色定位？ ③計(jì)算每包藥品中馬錢子的含量。（保留兩位有效數(shù)字）,①求出供試品斑點(diǎn)中士的寧的質(zhì)量②求出供試品中士的寧的含量,Ms = MR X =5 μl x 0.4 μg/ μl x

38、 =2.1μg,As,AR,,,19663.07,20617.25,含量（mg/包）=,Ms X 稀釋倍數(shù) X 標(biāo)示重量,取樣量,,=,,0.0021mg X 5ml X 20ml X 2.5g/包,0.005ml X 10ml X 2.098g,= 5.0（mg/包）,2.枳實(shí)導(dǎo)滯丸中橙皮苷的含量測定 本品系由枳實(shí)、大黃和黃連等八味藥材制成的水丸。中國藥典規(guī)定按干燥品計(jì)算，每1g含枳實(shí)以橙皮苷（C28H34O15

39、） 計(jì)，不得少于20.0mg。 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定（0.5124g），置索氏提取器中，加甲醇90ml，加熱回流4 小時(shí)，趁熱濾過至100ml 量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液與濾液合并，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5ml ，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。,對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1m

40、l 含0.05mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。 測定法 精密吸取供試品溶液5?、對(duì)照品溶液2 ? 與5 ? ，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇為展開劑，展開，展距約3cm ，取出，晾干，噴以 1％三氯化鋁的甲醇溶液，放置3 小時(shí)，在紫外光燈(365nm) 下定位。上機(jī)進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長：330nm ,線性掃描，測量供試品與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值（AR(2 ?) =885.7 AR (5 ?) =979.4

41、AS=835.6），計(jì)算，即得。★①聚酰胺TLC分離黃酮類成分效果較好故選之。 ②橙皮苷與AlCl3反應(yīng)顯色，在330nm紫外光下發(fā)射較強(qiáng)的綠色熒光（波長：500nm）。,回答問題： ①本法采用的是吸收測定法還是熒光測定法？外標(biāo)一點(diǎn)法還是外標(biāo)兩點(diǎn)法？透射法還是反射法？直線掃描還是鋸齒掃描？光源是什么？ ②求算枳實(shí)（橙皮苷）的含量（保留三位有效數(shù)字），并判斷是否

42、符合藥典規(guī)定。,(V2-V1) (A-A1),(A2-A1),①求算出斑點(diǎn)中橙皮苷的質(zhì)量 Ms = ? C +V1C,,=,,? 0.05mg/ml +2ul ? 0.05mg/ml,(979.4 － 885.7),(5ul－2ul) (835.6－885.7),=0.0198ug(1.98 X10 mg),②求算出枳實(shí)（橙皮苷）在藥品中的含量,含量（mg/g

43、）=,Ms X 稀釋倍數(shù),取樣量,,=,,,-5,,1.98 X10 mg X 2.5 X 10 ul X 1.0 X 10 ul,-5,,5,5,5ul X 5 X 10 ul X 0.5124g,3,=38.6,第四節(jié) 高效液相色譜法（HPLC）,一、概述 1、定義 以高壓液體為流動(dòng)相的液相色譜分析法稱為高效液相色譜法。,2、優(yōu)點(diǎn) “三高” 、“一快”、“一廣” 分離效能高—反復(fù)

44、多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果 選擇性高—可將性質(zhì)相似的組分分離 靈敏度高—10-11~10-13g，可適用于痕量分析 分析速度快—幾~幾十分鐘完成分離，一次可以測多種樣品 適用范圍廣—?dú)怏w、液體、固體物質(zhì)， 色譜柱可反復(fù)使用。 《中國藥典》中藥制劑含量測定最常用的分析方法。 缺點(diǎn)：對(duì)未知物分析的定性專屬性差、

45、需要與其他分析方法聯(lián)用,,3、類型 按固定相分類：液-液色譜法 液-固色譜法按原理分類：分配色譜法（液-液色譜） 吸附色譜法（液-固色譜） 液-液色譜法,正相色譜法 主要用于極性物質(zhì)的分離反相色譜法 主要用于非極性物質(zhì)分離,,二、色譜儀及其工作原理（P201圖）,高效液相色譜儀 一般由高壓輸液泵、進(jìn)樣閥、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

46、或色譜工作站組成。 工作原理 系用高壓泵將流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，通過進(jìn)樣閥注入樣品溶液，流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離，被分離成分依次進(jìn)入檢測器，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的電信號(hào)，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或色譜工作站進(jìn)行處理而得到分析結(jié)果。,1、高壓輸液系統(tǒng) 是將貯液器中的流動(dòng)相以高壓連續(xù)不斷地泵入裝有固定相的色譜柱。 配制好的流動(dòng)相應(yīng)用0.45um濾膜過濾，用前脫氣。2、進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用帶有定量管的六通進(jìn)樣閥。

47、3、色譜柱 最重要的分離部件，在中藥制劑的定量分析中，主要使用ODS柱。4、檢測器 HPLC最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，尚有二極管陣列檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器等。,二、含量測定方法（外標(biāo)法 ） 內(nèi)標(biāo)法 外標(biāo)法 藥物分析大多采用此法 1.系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 包括色譜柱的理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指標(biāo)。其中分離度和

48、重復(fù)性更具實(shí)用意義。 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)即用各品種項(xiàng)下規(guī)定的對(duì)照品和條件對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)符合要求。否則可對(duì)色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。,,（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）考察柱效 在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的對(duì)照物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長度計(jì)，下同,但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬(Wh/2),按下式計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。如果測得理論板數(shù)低

49、于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最 小理論板數(shù)，應(yīng)改變色 譜柱的某些條件（如柱 長、載體性能、色譜柱 充填 的優(yōu)劣等），使 理論板數(shù)達(dá)到要求。,（2）分離度（R） 考察分離效果 在規(guī)定的條件下，注入對(duì)照液或供試液，記錄色譜圖，按下式計(jì)算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度。除另有規(guī)定，分離度應(yīng)大于1.5。,,（3）重復(fù)性 考察測量的精密度 在規(guī)定條件下，取一定量的對(duì)照液，連續(xù)進(jìn)

50、樣3～5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于2.0％。 （4）拖尾因子（T） 考察色譜峰的對(duì)稱性，保證測量的準(zhǔn)確度。特別是采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的T是否符合規(guī)定。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05之間。,,式中:W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。,2.對(duì)照品溶液的制備 3.供試品溶液的制備 4.測定法

51、將上述兩種溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖，按下式計(jì)算被測成分的含量。 （1）求出供試液中被測成分的濃度C供 （2）求出藥品中被測成分的含量,C供＝C對(duì),,A對(duì),A供,三、應(yīng)用實(shí)例 1.牛黃解毒片中黃芩的含量測定 本品由牛黃、大黃、黃芩、冰片、石膏等八味中藥制成。中國藥典以黃芩苷為指標(biāo)，采用HPLC測定其中黃芩的含量。 （1）色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 固定

52、相：用十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），流速1ml/min； 檢測器：紫外檢測器，檢測波長為315nm；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。 （2）對(duì)照品溶液制備 精密稱取在60℃減壓干燥4小時(shí)的黃芩苷對(duì)照品適量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2µg的對(duì)照品溶液。,（3）供試品溶液制備 取牛黃解毒

53、片20片，剝?nèi)ヌ且?，精密稱定（6.254g），研細(xì)，精密稱取1.045 g，加70%乙醇30ml，超聲處理20分鐘，放冷，濾過，濾液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)匆簽V于同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。 （4）測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10µl進(jìn)樣，測得對(duì)照品及供試品中黃芩苷的峰面積分別為A供＝4340441，A對(duì)＝3945856。,,2.藿香

54、正氣水中厚樸酚與和厚樸酚總量的測定 本品由蒼術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷等十味中藥制成的液體制劑，每支裝10ml（標(biāo)示裝量）。其中厚樸為要藥之一，故《中國藥典》采用HPLC，以厚樸酚及和厚樸酚的總量為指標(biāo)，控制厚樸的含量。 （1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-乙腈-水（50:20:40）為流動(dòng)相；檢測波長294nm。理論板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。 （

55、2）對(duì)照品溶液的制備 取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1ml含厚樸酚0.2mg、和厚樸酚0.1mg的溶液，搖勻，即得。,（3）供試品溶液的制備 精密量取裝量項(xiàng)下的本品5ml，加鹽酸2滴，用氯仿振搖提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒕芟♂屩?0ml，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。,（4）測定法

56、 精密吸取上述三種溶液各10μl，分別注入液相色譜儀測定，根據(jù)對(duì)照品的峰面積（AR厚 AR和）以及供試品中被測成分的峰面積（AS厚 AS和）計(jì)算厚樸的含量。本品每支含厚樸以厚樸酚（ C18H18O2 ）及和厚樸酚（C18H18O2）的總量計(jì)，不得少于5.8mg。,混合對(duì)照品. 和厚樸酚 厚樸酚 樣品,2.和厚樸酚 3.厚樸酚 5.6.其他成

57、分峰,四、安全操作注意事項(xiàng) 1.流動(dòng)相需用微孔濾膜（0.45μm）濾過并脫氣才可使用。 2.開泵后，先打開沖洗鍵（PURGE）進(jìn)行泵排氣。然后將流動(dòng)相接入色譜柱充分沖洗平衡，待基線穩(wěn)定后方可進(jìn)樣。 3.測試溶液需用微孔濾膜（0.45μm）濾過。 4.使用鍵合硅膠柱，流動(dòng)相的PH值應(yīng)控制在2～8，否則色譜柱很容易損壞。 5.由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于使用C18柱的反相色譜系統(tǒng)，

58、流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5％。否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值的改變，造成色譜系統(tǒng)的不穩(wěn)定。 6.工作完畢，應(yīng)先后用水和甲醇充分沖洗液路系統(tǒng)，尤其是使用了含鹽的流動(dòng)相，更應(yīng)充分沖洗。,第五節(jié) 氣相色譜法 （GC） 氣相色譜與液相色譜的根本區(qū)別：流動(dòng)相不同 一、概述 1、定義 以氣體為流動(dòng)相（亦稱載氣）的色譜分析法稱氣相色譜法。,2、特點(diǎn)

59、 分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等。在中藥制劑中主要用于揮發(fā)油及其他揮發(fā)性組分的含量測定，還可用于水分、乙醇量的測定。但本法也存在一定局限性，它對(duì)揮發(fā)性差或遇熱易分解破壞的物質(zhì)難以分析。 3、分類 1.按固定相狀態(tài)分類：氣固GC、氣液GC 2.按分離原理分類：吸附GC、分配GC 3.按色譜柱分類：填充柱GC、毛細(xì)管柱GC （分辨率高（n>10 ）常用于農(nóng)殘分析）,二、儀器及其工作原

60、理 工作原理 加熱分析樣品使其氣化，由載氣帶入色譜柱，由于各組分在固定相與載氣間分配系數(shù)不同，故在色譜柱中移動(dòng)速度不同，經(jīng)一段時(shí)間后彼此得到分離，再依次被載氣帶入檢測器，將各組分的濃度或質(zhì)量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并記錄成色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰高或峰面積而進(jìn)行定量分析。,五、含量測定 內(nèi)標(biāo)法 常用于藥物分析。 外標(biāo)法 少用，因?yàn)镚C進(jìn)樣量小，造成的誤差較大。

61、 1.色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) （1）色譜條件 主要包括載氣、色譜柱、檢測器、固定液（相）測試溫度、進(jìn)樣量、載體等。其中檢測器種類、固定液品種、以及色譜柱的材質(zhì)不得改變，其它的如柱子的內(nèi)徑和長度、載體的種類和粒度、固定液涂布的濃度、載氣的流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等可適當(dāng)改變，以適應(yīng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。,,①載氣：一般為N2，還可用H2、He。 ②色譜柱：玻璃柱和不銹鋼柱。 ③檢測

62、器: 氫火焰離子檢測器（氫焰檢測器 FID） 適合有機(jī)物檢測，靈敏度高，應(yīng)用廣泛。 熱導(dǎo)檢測器（TCD） 無機(jī)物、有機(jī)物均可檢測，靈 敏度較低，用于水分測定。 電子捕獲檢測器（ECD） 適合含鹵素、硫、氮等電 負(fù)性強(qiáng)的元素的化合物測定。用于農(nóng)殘測定。,④柱填料：吸附劑：硅膠、氧化鋁等。較少用。高分子多孔小球：常用二乙烯苯乙基乙烯苯型的。氣固吸附GC

63、 例如甲（乙）醇量、水分的測定。涂漬固定液的載體（多用）：常用經(jīng)酸洗并硅烷化的硅藻土（ 紅色載體、 白色載體）屬氣液分配GC。⑤固定液：常用甲基聚硅氧烷（如SE-30、OV-17等）、 聚乙 二醇（如PEG-20等），一般涂布濃度為5～25％。（2）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)（同HPLC）,,2.內(nèi)標(biāo)法（同

64、乙醇量測定法）（1）標(biāo)準(zhǔn)液的制備（2）供試液的制備（3）校正因子（f）的測定 內(nèi)標(biāo)法特有的參數(shù)。,內(nèi)標(biāo)法測定時(shí)，同一檢測器對(duì)不同（被測成分和內(nèi)標(biāo)物）具有不同的響應(yīng)值，故不能用峰面積直接計(jì)算的被測成分的含量，要引入校正因子。 校正因子（f ） 藥典中采用的是相對(duì)重量校正因子（fw）。其定義為：被測成分（i）單位峰面積所相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)量（Mi/Ai）是內(nèi)標(biāo)物（s）單位峰面積所相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)量（Ms/As）的

65、多少倍。 內(nèi)標(biāo)物的選擇原則： ①應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)。②加入量應(yīng)接近于被測成分。③其色譜峰應(yīng)位于被測成分色譜峰附近且與之完全分離。,六、應(yīng)用實(shí)例 十滴水軟膠囊中樟腦含量的測定 本品由樟腦、干姜、大黃、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中藥制成，樟腦是其主成分之一，具升華性，故采用氣相色譜法，以樟腦為對(duì)照品，薄荷腦為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)其進(jìn)行含量測定。 1.色譜條件與系統(tǒng)適用

66、性試驗(yàn) 以聚乙二醇（PEG）-20M為固定相，涂布濃度為10%，柱溫150℃。理論塔板數(shù)按樟腦峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，樟腦峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2。,2.校正因子測定 精密稱取樟腦對(duì)照品（r）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷腦內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(s)50mg，加無水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1～2μl，注入氣相色譜儀， Ar=211948、As=215835，計(jì)算校正因子（保留四位有效數(shù)字）

67、 。 3.測定法 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，取0.8g，精密稱定（0.7956g），置具塞試管中，用無水乙醇提取5次，每次4ml，分取乙醇提取液，合并，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，精密加入薄荷腦125mg，使溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液(i＋s)。精密量取1～2μl，注入氣相色譜儀測定， Ai＝108685、 As＝123544，計(jì)算即得（保留兩位有效數(shù)字)。,解答問題 ①本法屬于氣液分

68、配GC還是氣固吸附GC？ ②使用哪種載氣？哪種檢測器？ ③采用的是外標(biāo)法還是內(nèi)標(biāo)法？ ④求算樟腦的含量。藥典規(guī)定，本品每粒含樟腦不得少于53mg。（平均粒重0.425g／粒）求算校正因子（f） f =(As/AR) X(MR / Ms ) = (215835/ 211948)/(