禽病原性大腸桿菌E058株iutA、iucB及chp1、chp2基因突變株的構建及其致病性評價.pdf

1、禽大腸桿菌病(Avian colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。禽大腸桿菌病是2至12周齡雞和火雞的一種常見傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)

2、濟損失。大腸桿菌血清型復雜多樣，在APEC中最常見的血清型是O1、O2和O78。鐵是細菌代謝必須的營養(yǎng)因子，細菌生長所需鐵(離子)濃度約為10-7 M，病原性大腸桿菌天然形成了特定的利用鐵元素的系統(tǒng)(specificiron assimilation system)，Williams最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)[1]，這一系統(tǒng)由嗜鐵體(siderophore)、氣桿菌素(aerobactin)的合成和氣桿菌素特定的外膜蛋白受體(由iu

3、tA編碼)的表達兩部分組成。細菌的這兩種成分在鐵饑餓(ironstarvation)的情況下，均能得到強烈誘導表達。流行病學調查表明，氣桿菌素相關基因只存在于有毒力菌株，在無毒力菌株中未發(fā)現(xiàn)。本研究旨在研究氣桿菌素家族的iutA、iucB基因與致病性之間的關系，了解APEC iutA與iucB基因突變株的生物學特性。本研究的實施，有利于澄清APEC ColV質粒編碼的氣桿菌素編碼基因iucABCDiutA中單個基因及其組合對其致病性的影

4、響，為揭示APEC的致病機理及進一步構建APEC弱毒疫苗株奠定基礎。
　　 本研究第一章運用等位基因交換的方法構建iutA、iucB的單基因和雙基因缺失突變株。PCR擴增帶有酶切位點的iutA、iucB基因并將其插入到pBSK載體多克隆位點中相應酶切位點處，再運用分子克隆的方法將Kanamycin抗性基因和Zeocin抗性記憶分別插入插入到目的基因iutA和iucB中，構建出帶Kanamycin抗性基因標志的載體pS-iutA-

5、Kan和帶Zeocin抗性基因標志的載體pS-iucB-Zeo，通過PCR擴增片段iutA-Kan和iucB-Zeo，并電轉化入禽病原性大腸桿菌分離株E058中，根據(jù)同源重組原理，篩選出E058株的基因突變株E058iutA及E058iucB，將片段iucB-Zeo電轉化入單突變株E058iutA中，篩選出雙突變株E058iutAiucB。
　　 Southern blot的結果顯示Kanamycin、Zeocin抗性基因在AP

6、EC E058株基因突變株的pAPEC-O2-ColV質粒中的插入是單拷貝的；RT-PCR結果表明突變株的iutA、iucB基因不能轉錄，而其上下游基因的轉錄未受到影響；SDS-PAGE結果表明iutA、iucB基因突變后，蛋白條帶大小及表達量發(fā)生了變化，通過回復拯救試驗，可見蛋白表達與野生株E058一致；氣桿菌素產(chǎn)生試驗及ColV產(chǎn)生試驗結果表明，E058、E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB均能產(chǎn)生氣桿菌素和

7、ColV；E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB株較E058株在生長速度上稍有降低；在血清殺菌性實驗中，突變株對SPF雞血清的補體殺菌作用不敏感；體內(nèi)外競爭實驗結果表明，突變株對E058株競爭力很弱；E058、E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB株的半數(shù)致死量(LD50)為分別為104.7、105.7、105.8和106.8CFU；在35日齡SPF雞的致死性試驗中，E058株所致死亡率為95

8、％，而E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB突變株所致死亡率分別為70％(p＜0.05)，60％(p＜0.01)及45％(p＜0.01)；12日齡SPF雞胚的致死性實驗結果表明，E058組死亡率為63.3％，而E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB突變株組死亡率為40％、33.3％(p＜0.05)及30％(p＜0.01)。SDS-PAGE結果表明iutA、iucB基因突變后，蛋白條帶大小及表達

9、量發(fā)生了變化，通過回復拯救試驗，可見蛋白表達與野生株E058一致，上述結果揭示iutA、iucB基因與APEC E058株的致病性有一定的關系。
　　 基于實驗室前期《禽病原性大腸桿菌的生物學特性及其可能毒力相關基因二》的研究中，抑制差減雜交(SSH)獲得32個APEC E058株基因差異片段之一的aes-31序列，其功能未知，與UPEC同源。本實驗第二部分選擇aes-31片段作為研究對象，運用等位基因交換的方法構建chp1、c

10、hp2的單基因和雙基因缺失突變株。PCP擴增chp1、chp2基因并將其插入到pBSK載體的多克隆位點中，再運用分子克隆的方法將Zeocin抗性基因和Kanamycin抗性基因分別插入插入到目的基因chp1和chp2中，構建出帶Zeocin抗性基因標志的載體pSK-chp1-Zeo和帶Kanamycin抗性基因標志的載體pSK-chp2-Kan，通過PCR擴增片段chpl-Zeo和chp2-Kan，并電轉化入禽病原性大腸桿菌分離株E05

11、8中，根據(jù)同源重組原理，篩選出E058突變株E058chp1及E058chp2，將片段chp1-Zeo電轉化入E058chp2，篩選出雙突變株E058chp1chp2。
　　 Southern blot結果顯示Zeocin抗性基因片段的插入是單拷貝的，Kanamycin抗性基因片段在chp2突變株全基因組中插入了兩個拷貝；RT-PCR結果表明被突變的chp1基因已經(jīng)不能反轉錄，未被完全突變的chp2基因仍能反轉錄，其上下游基因并