水稻抗瘟病品種黑殼子粳基因組文庫和抗病基因Pihk1(t)定位區(qū)段的特征分析.pdf

1、稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr[無性世代為Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc]引起的世界性水稻病害，對水稻生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。以各種抗病性的種質(zhì)資源為基礎(chǔ)，通過分子標(biāo)記輔助(MAS)育種和基因工程（轉(zhuǎn)基因）的手段，可以有效地將多個專化抗性基因轉(zhuǎn)育到優(yōu)良農(nóng)藝性狀已有品種中，從而加快育種進(jìn)程，提高品種對稻瘟病的抗性，增強(qiáng)穩(wěn)產(chǎn)性。
　　 黑殼子粳是一個來自于太湖流域?qū)Φ?/p>

2、瘟病菌表現(xiàn)廣譜高抗的地方水稻品種。按照圖位克隆的技術(shù)路線，前期的研究工作將黑殼子粳上的抗稻瘟病基因定位到第11染色體RM7654和In5之間，命名為Pihk1(t)。
　　 為克隆到抗稻瘟病基因Pihk(t)，本文以黑殼子粳為材料構(gòu)建基因組BAC文庫。在Danial G.Peterson BAC文庫構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，對實驗步驟做了一些改進(jìn)，建立了構(gòu)建水稻基因組BAC文庫的一套比較完整的體系。該文庫以plndigo BAC5為載體

3、，包含有39936個克隆。經(jīng)酶切、電泳檢測，平均插入片段為70 Kb，按照水稻430 Mb的基因組大小來估算，文庫覆蓋水稻基因組的6.5倍。
　　 以黑殼子粳基因組文庫為基礎(chǔ)，構(gòu)建了便于PCR篩選的混合池。最初的文庫為初級池，由104個384孔板組成，復(fù)制一份作為永久保存。將初級庫的縱行合并為二級池，二級池橫行合并為三級池。對三級池的所有混樣菌液提取質(zhì)粒，用Pihk1(t)緊密連鎖的標(biāo)記RM7654和In5通過PCR的方法，根據(jù)

4、三維篩選體系篩選陽性克隆，獲得4個該位點的陽性單克隆。陽性克隆經(jīng)末端測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物進(jìn)行染色體步移篩選鄰近克隆，共獲得6個陽性單克隆，重疊群覆蓋基因組區(qū)間將近140 Kb。
　　 挑選覆蓋Pihk1(t)定位區(qū)間及其上游的克隆BAC No.242和BAC No.66P14進(jìn)行基因組測序，以日本晴序列為參照，發(fā)現(xiàn)RM7654和In5之間黑殼子粳存在5 Kb的插入，其中包含一個類似反轉(zhuǎn)座子的序列，其對黑殼子粳的抗病效果可能