廣西馬源H9N2亞型流感病毒的分離鑒定與全基因組序列分析.pdf

1、本研究采用RT-PCR和血清學相結(jié)合的方法對從廣西4個市采集的馬肺組織樣品和馬血清進行H9N2亞型流感病毒的檢測，從284份馬肺組織樣品接種雞胚后收取的尿囊液中，檢測出1份陽性，陽性率為0.35％；而檢測的1110份馬血清，H9N2亞型陽性有7份，陽性率為0.54％。應用雞胚接種的方法分離出一株病毒，通過血凝抑制實驗及對8個片段的全基因克隆及序列分析，鑒定為H9N2亞型流感病毒，將分離株命名為A/equine/Guangxi/3/201

2、1(H9N2)(簡稱GX3株)。對GX3株進行雞胚半數(shù)致死量(ELD50)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種指數(shù)(ICPI)測定試驗，其ELD50和ICPI值分別為10-6.43/0.2mL和0.09；經(jīng)免疫效果試驗證明GX3株具有較好的免疫原性；對GX3株各基因的關(guān)鍵位點分析發(fā)現(xiàn)，GX3株HA基因的氨基酸在第183、225、227及228位點處均非常保守，而在226位氨基酸為亮氨酸(Leu)，具有受體SAα-2，6-Gal特異性；在HA裂解位點處含

3、有2個堿性氨基酸，其HA1與HA2氨基酸裂解位點處的序列為RSSRGLF，具有典型的低致病性流感病毒裂解位點的氨基酸序列特征；PB2基因第627、701、714位氨基酸分別為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)，PB1-F2蛋白的第66位氨基酸為天冬酰胺(Asn)，NP基因第319位氨基酸為天冬酰胺(Asn)，NS1蛋白的第92位氨基酸為天冬氨酸(Asp)，這些都說明GX3株為低致病性毒株。糖基化位點分析中，HA和NA

4、基因均具有8個糖基化位點，其中HA在第313位氨基酸處比參考毒株多出一個糖基化位點，NA在第44位氨基酸位點處比參考毒株多出一個糖基化位點，而其余的糖基化位點均比較保守，沒有出現(xiàn)明顯改變。耐藥性基因位點分析中，NA基因119E、151D、276E、292R、294N，表明GX3株對神經(jīng)氨酸酶抑制類藥物敏感；M2基因S31N，表明GX3株具有金剛烷胺類藥物的抗性。通過系統(tǒng)進化樹及核苷酸同源性分析可知GX3株各個基因片段的大體來源：PB2和