藥學專業(yè)畢業(yè)論文外文翻譯--高表達和純化的tat-hafgf19-154

1、<p><b>　　中文4912字</b></p><p><b>　　譯文：</b></p><p>　　高表達和純化的Tat-haFGF19-154</p><p>　　High-level expression and purification of Tat-haFGF19-154</p>&

2、lt;p>　　Yadong Huang, Yulan Rao, Chengli Feng, Yanmei Li, Xiaoping Wu, Zhijian Su,</p><p>　　Jian Xiao, Yechen Xiao, Wenke Feng, Xiaokun Li</p><p>　　摘要：人的酸性成纖維細胞生長因子在各種組織損傷后能夠刺激修復和再生中央和周圍神經(jīng),然而，

3、它不能穿過血腦屏障。為了生產(chǎn)具有細胞滲透性的治療性的酸性成纖維細胞生長因子，我們用Tat-PTD技術(shù)融合haFGF19-154基因。在這之后用PCR技術(shù)擴增編碼序列，使pTathaFGF19-154-His在大腸桿菌BL21中得以表達。最佳表達的可溶性融合蛋白超過了總細胞蛋白的36.7%。Tat-haFGF19-154-His的重組體被具有Ni–NTA活性，葡聚糖凝膠G-25和肝素親和的色譜柱組合體純化95%。這數(shù)據(jù)用十二烷基硫酸鈉—聚

4、丙烯酰胺酰胺凝膠電泳檢測得到，最終產(chǎn)率為171 mg/l培養(yǎng)物。純化的Tat-haFGF19-154-His具有在Balb/c3T3細胞中不同的有絲分裂促進活性，用MTT法測量它的半數(shù)有效量為3.931×10?4 μmol/l。Tat-haFGF19-154-His的蛋白以每劑量為10 mg/kg靜脈注射在大腦皮層和海馬中檢測得到。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 酸性成纖維細胞生長因子；Tat-PTD表

5、達；純化；有絲分裂促進活性</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　人酸性成纖維細胞生長因子（haFGF）是一個有力的廣譜促細胞分裂劑。體外研究顯示酸性成纖維細胞生長因子能刺激細胞生長過程中對胚層和神經(jīng)外胚層來源（Gimenez-Gallegoand Cuevas 1994）的影響?？咚沟仍?997年到1998年間發(fā)現(xiàn)，酸性成纖維細胞生長因子具

6、有內(nèi)分泌類的活動，可以作為一個血管擴張，內(nèi)臟缺血的保護者，調(diào)節(jié)神經(jīng)。酸性成纖維細胞生長因子在神經(jīng)生長和發(fā)展中起著舉足輕重的作用。以往的研究表明，酸性成纖維細胞生長因子在海馬，紋狀體和下丘腦神經(jīng)細胞增殖的同時增強生存能力和刺激睫狀視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及刺激周邊神經(jīng)元。這是1988年立頓等人和1991維爾科克廝等人所證明的。haFGF能夠促進神經(jīng)上皮細胞遷移和規(guī)范對腦神經(jīng)祖細胞的分化和促進修復和再生有傷的中樞和外周神經(jīng)，之后還能營養(yǎng)作用神經(jīng)元。這

7、是英杰和博恩在1992年及納曼在1996年所證明的。外源性的haFGF具有以衰減最初的毒物的可創(chuàng)性和持續(xù)時間來減輕海馬細胞的消亡和神經(jīng)元細胞的消亡 (Cuevas et al. 1994; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996)。haFGF有效保護了由腦</p><p>　　在跨越血腦屏障（BBB）的治療性蛋白質(zhì)交付限制其規(guī)模和生物化學特性。具有154個氨基酸的haFGF蛋白質(zhì)，不能直接

8、穿過血腦屏障從循環(huán)，但可以通過腦內(nèi)注射入腦室(Li et al. 1998; Mufson et al. 1999)，滲透性開放的血腦屏障(Rapoport 2000; Emerich et al. 2001)或病毒載體(Federoff et al.1992). 不過，腦內(nèi)注射可能會損害大腦組織，引起感染。開放是選擇性滲透，不可能允許進入大腦的其他物質(zhì)進入。基因治療有經(jīng)驗的低效配置和較低的長期蛋白的表達。因此，aFGF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾

9、病的治療在臨床方面還受到嚴重的限制。</p><p>　　近年來，新的戰(zhàn)略已經(jīng)發(fā)展為加強血腦屏障的通透性(Schwarze et al. 1999;</p><p>　　Bayley 1999; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006)。一種方法是融合靶蛋白和穿膜肽細胞(CPPs)，如Tat-PTD，控制觸角基因的蛋白，單一的皰疹病毒-1VP22,卡波西氏的成

10、纖維生長因子信號序列(Bayley 1999; Dietz et al. 2002)。Tat-PTD，來自艾滋病毒反式轉(zhuǎn)錄激活（TAT）獲得的9或11個氨基酸片段，與各種蛋白質(zhì)進行融合后運送到大腦(Elliott and O’Hare 1997)。到目前為止，幾個TAT融合蛋白，如PTD-Bcl-xL, PTD-GDNF, PTD-tyrosine hydroxylase,PTD-calpastatin, and PTD-SOD，已被證

11、明具有穿越血腦屏障的療效并有治療作用。在腦疾病實驗?zāi)Ｐ?Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al.2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006; Wu et al. 2006).</p><p>　　這項研究中，我們對haFGF19-154和Tat-PTD 49-57與蛋白進行融合后在大

12、腸桿菌中高效表達和純化成接近同質(zhì)。純化的融合蛋白具有明顯的促進有絲分裂活性，并能夠跨越血腦屏障。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　試劑</b></p><p>　　限制性內(nèi)切酶Nde I and BamH I購買來自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；

13、標準haFGF(haFGF19-154)購自廣州維佳（廣州,中國）；質(zhì)粒pET - haFGF19 - 154，表達載體pET3c和大腸桿菌菌株BL21（DE3）獲得來自生物醫(yī)藥研究開發(fā)中心濟南大學；Ni-NTA瓊脂糖是從Invitrogen公司（美國）；CM–瓊脂糖和肝素-瓊脂糖由GE醫(yī)療保健公司(Piscataway, NJ, USA)；引物合成由上海生工（上海，中國）；兔抗多克隆抗體，從武漢博士德生物工程有限公司（武漢，中國）購買

14、。</p><p>　　構(gòu)建Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His表達載體</p><p>　　這Tat-haFGF19-154-His互補DNA被放大由質(zhì)粒pET-haFGF19-154由標準聚合酶鏈反應(yīng)是由正向引物F1(5′-GGAATTCCATATGCGCAAAAAACGTCGTCAGCGTCGCCG</p><p>　

15、　TGCTAACTACAAG-3′) 和反向引物R(5′-GCAGATCTTTAGTGATGATGATGATGA</p><p>　　TGATCAGAAGAAACTGGCAA-3′)。正向引物F1和反向引物R分別包含NdeI and BglII 位點一種近似的465堿基擴增片段被NdeI and BglII切斷然后再將其克隆到pET3c表達載體,這載體是先前已經(jīng)與被NdeI和BamHI酶切消化，建立相應(yīng)的表達載體

16、pTat-haFGF19-154-His。另一種表達載體pTat-haFGF19-154-His，它是通過相同的程序產(chǎn)生上述使用正向引物F2(5′-GGAATTCCATATGGCTAACTACAAGAAGCCAA</p><p>　　AGTTG-3′)和反向引物R.插入基因的精確度通過自動化的DNA序列測定所證實的。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His and ha

17、FGF19-154-His的誘導和表達</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His被表達如下：單一轉(zhuǎn)化菌落在4毫升中型的LB（10g蛋白胨,10g酵母提取物,5g氯化鈉溶入到1升的去離子水中）培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含100 μg/ml氨芐西林和1%葡萄糖且在37°C轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng).經(jīng)過隔夜培養(yǎng)，100μl的培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到50毫升新鮮的不包含葡萄

18、糖的LB培養(yǎng)基中,為了達到指數(shù)生長，就是當OD600值達到0.6，異丙基-D-半乳糖硫吡喃糖苷類（IPTG)被增加到0.4 mmol/l終濃度。培養(yǎng)物培養(yǎng)在37°C和220轉(zhuǎn)動6個小時Tat-haFGF19-154-His 和</p><p>　　haFGF19-154-His被十二烷基鈉硫酸鹽聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)，和他們表達水平被光密度計掃描器分析出來。為haFGF19-154-His達

19、到純化的目的,培養(yǎng)物被放大到1.0升的培養(yǎng)基里。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His的發(fā)酵</p><p>　　10微升種子菌株BL21（DE3）中有pTat-haFGF19-154-His表達質(zhì)粒，它是培養(yǎng)過夜的50毫升LB培養(yǎng)基中有100μg/ml氨芐青霉素（約12-14小時;在220 rpm, 37°C下旋轉(zhuǎn)）。接著，10毫升的過夜培養(yǎng)基接種到新鮮的

20、200毫升LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中含有100μg/ml氨芐青霉素和在220 rpm, 37°C下?lián)u床培養(yǎng)，當OD600值達到1.0，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€5升發(fā)酵罐包含3升的LB培養(yǎng)基,在這之后OD600達到20。IPTG被增加到培養(yǎng)基中含有0.4 mmol/l.終濃度.誘導過程持續(xù)了5小時,細胞通過離心5分鐘（時速為13,523×g在溫度為4°C）來收集。然后片狀樣的細胞被懸浮在20 mmol/l冰冷的包含5

21、mmol/l EDTA (PBS)緩沖溶液當中。懸浮液在冰冷器中超聲處理然后離心30分鐘在轉(zhuǎn)速為30,427×g溫度為4°C。片狀沉淀物被清除，上清液被進一步純化。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His的純化</p><p>　　細胞裂解物被用于一個勻稱的Ni–NTA柱中含有20 mmol/l PBS buffer。用500毫升的洗滌劑緩沖溶液I

22、(20 mmol/l PBS containing 10 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH8.0)清洗樹脂至到OD280價值達到基線。洗滌劑緩沖溶液II (20 mmol/l PBS containing 20 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)被適用于洗滌非特異性蛋白。最后，這個6xHis的標記融合蛋白被洗脫液(20 mmol/l

23、PBS containing 300 mmol/l imidazole and additional 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)清洗。這碎片包含了融合蛋白被用于一個Sephadex G-25均衡柱中含有0.6 mol/l 氯化鈉的20 mmol/l PBS buffer (pH 7.4)片段被混合，用一個勻稱的heparin–Sepharose柱由上述的洗滌液來洗滌。凝結(jié)蛋白被含有1.2 mol/l 氯化鈉的20

24、</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His細胞增殖活性的分析</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His重組體的能力，他以加速對用（MTT）比色法對Balb/c 3T3細胞增殖來檢測計量。Balb/c 3T3細胞用0.25％胰蛋白酶消化和用成96孔板（7,000 /孔）接種。細胞用RPMI 1640補充有10%胎牛血清，100 U/ml氨芐青霉素，和100

25、 U/ml鏈霉素在37°C下培養(yǎng)24個小時和此后再在含有0.4%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24個小時。這些細胞比新鮮的培養(yǎng)基中含有不同Tat-haFGF19-154-His，haFGF19-154-His ，野生型haFGF的濃聚物。經(jīng)過24-48 小時的培養(yǎng)，細胞在100微克的每個MTT套管 中培養(yǎng)4個小時。該培養(yǎng)基被移除，然后150μl的二甲基亞砜加入到每孔。經(jīng)過30分鐘在室溫下孵化，存活細胞的數(shù)量立即通過測量在570 nm處的

26、吸光度來估計。實驗重復五次。</p><p><b>　　免疫組織化學分析</b></p><p>　　配制haFGF19-154-His (1 mg/ml) 和 Tat-haFGF19-154-His(1 mg/ml在 0.9% 鹽溶液)溶液，然后儲藏在零下20°C，總重105克的小鼠（雄的20±2克，廣東醫(yī)藥實驗動物中心）分成3小組（每35克一

27、組）。兩組老鼠分別由尾靜脈注射入劑量為10 mg/kg aFGF19-154-His 和 Tat-haFGF19-154-His的溶液。第三組老鼠注射相同量0.9%的鹽溶液，老鼠被麻醉之后移除它們的大腦在30分鐘，1個小時，2個小時，4個小時，8個小時，12個小時和24個小時在服用藥物之后（5只老鼠每個時間點）。腦組織固定在4％低聚甲醛溶液在4 ° C和用免疫組織化學分析。陽性的細胞數(shù)量在顯微鏡下能被計算出來。在顯微鏡下隨機挑

28、選十個視野，和在100個細胞中平均陽性細胞的數(shù)量來決定的。正染色的缺少被視作消極結(jié)果。</p><p>　　圖1. 圖解Tat-haFGF19-154-His和控制haFGF19-154-His融合蛋白</p><p>　　圖2. E.coli BL21(DE3)/ TAT-HA-aFGF14-154工程菌的發(fā)酵與純化</p><p><b>　　結(jié)果&

29、lt;/b></p><p>　　構(gòu)建和表達重組體Tat-haFGF19-154-His</p><p>　　haFGF的全長由154氨基酸組成。即使N末端首位的氨基酸被刪除在穩(wěn)定性和生物學的haFGF形式上也沒有顯著的差別 (Luo et al. 1996; Imamura et al. 1990)。為了生產(chǎn)出具有細胞滲透性的haFGF19-154融合蛋白，一個具有Tat- haF

30、GF19-154-His的基因表達型載體被構(gòu)建，一個沒有Tat域重組質(zhì)粒也被做為構(gòu)建以此來對照（圖1）。當培養(yǎng)物達到中間對數(shù)期生長時，包含Tat- haFGF19-154-His或者haFGF19-154-His的E. coli細胞在0.4 mmol/l IPTG的誘導下使兩個融合蛋白在溶液里表達(the ~17.3-kDa Tat- haFGF19-154-His and ~16.0-kDa haFGF19-154)。大約在5個小時誘

31、導之后總計表達重組體Tat- haFGF19-154-His占總細胞蛋白的36.7%（圖2）。</p><p>　　圖3. 用Ni-NTA親和色譜在E. coli表達的純化Tat-haFGF19-154-His。在Ni-TNA樹脂上應(yīng)用細胞裂解物，能被不同的咪唑和濃縮的氯化鈉泳道分子技術(shù)洗脫</p><p>　　純化和鑒定重組體Tat-haFGF19-154-His</p>

32、<p>　　在發(fā)酵之后，離心和溶解細胞并收集。細胞裂解物被用于一個Ni–NTA親和柱。</p><p>　　缺少6xHis標記的蛋白質(zhì)用含10 和20 mmol/L咪唑的硫酸緩沖溶液的Ni–NTA樹脂，和包含TathaFGF19-154-His片段洗脫使用包含300 mM imidazole的PBS（圖3）。通過葡聚糖凝膠G-25和瓊脂糖–肝素的組合體親和色譜柱進一步純化。Tat-haFGF19-15

33、4-His的純度比用光密度測定的95% 銀染SDS-PAGE 凝膠還要高（圖4）。表1是概述純化的結(jié)果。純化的Tat-haFGF19-154-His重組體的最終產(chǎn)率大約為171 mg/1的培養(yǎng)物。蛋白印跡法顯示純化的TathaFGF19-154-His和haFGF19-154-His是經(jīng)過6xHis的抗體驗證的（圖4.）。</p><p>　　圖4 . SDS-PAGE和蛋白印跡分析的關(guān)于純化的TathaFGF

34、19-154-His和對照的haFGF19-154-His</p><p>　　融合蛋白。左側(cè)著銀色的是SDS-PAGE凝膠，右側(cè)是用抗-6xHIS抗體的蛋白印跡。利用泳道分子技術(shù)，第一泳道是純化的TathaFGF19-154-His，第二泳道是純化的haFGF19-154-His。</p><p>　　圖5 野生型haFGF、haFGF19-154-His和Tat-haFGF19-154

35、-His在Balb/c 3T3細胞上的促有絲分裂的影響。</p><p>　　表1. 對Tat-haFGF19-154 在E.coli中表達純化的綜述</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His重組體促進有絲分裂活性</p><p>　　由MTT分析法得知，純化的Tat-haFGF19-154-His的促進有絲分裂的活性比類似的野生的haFGF19

36、-154-His低（圖5）。這個減少的合理解釋可能是部分Tat-haFGF19-154-His被Tat-PTD和不能互相影響在細胞表面的纖維母細胞受體直接陷入。這個機理的提出是通過成纖維細胞生長因子的功能。</p><p>　　圖6測定關(guān)于在在玻璃體內(nèi)大腦皮層和海馬的Tat-aFGF19-154-His。利用抗6xHis的抗體采用免疫組織化學的方法在玻璃瓶內(nèi)對有aFGF19 - 154(a, c)和Tat-aFG

37、F19-154-His(b, d)的細胞給予八小時。紅色箭頭表示的是標準的陽性染色。A和B代表海馬檢測。C和D代表大腦皮層檢測。</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His 的融合蛋白轉(zhuǎn)導入大腦</p><p>　　來測定純化的Tat-haFGF19-154-His 是否能夠通過血腦屏障，由尾靜脈單劑量10 mg/kg Tat-haFGF19-154-His注射入小老鼠。T

38、at-haFGF19-154-His融合蛋白在注射8小時之后用免疫組織化學法測定到分布在大腦皮層和海馬當注射具有可控蛋白的haFGF19-154-His和生理鹽水時，沒有陽性的免疫染色不是在海馬(圖6a)就是在大腦皮層（圖6c）中被找到。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　酸性成纖維因子是一的強大的促細胞分裂劑和有效的營養(yǎng)因子。外源的酸性成

39、纖維因子已經(jīng)被證明可以在體內(nèi)預防許多大腦區(qū)域的神經(jīng)元退化和細胞凋亡(Date et al. 1990;Sasaki et al. 1992; Cuevas et al. 1994; Figueiredo et al.1995; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996; Alexi et al.2000; Jankowsky and Patterson 2001).。血腦屏障不僅阻礙大腦藥物的發(fā)展，而且是限制神經(jīng)病

40、療法發(fā)展的最重要因素(Schwarze et al. 1999).一個穿膜肽細胞，Tat-PTD，被融合到各種目的蛋白上，這是一種已經(jīng)被廣泛使用的把藥物傳遞到大腦的方法(Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al. 2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006;Wu et al. 2006)。在目前的研究中顯示T

41、athaFGF19-154的融合蛋白能夠在E. co</p><p>　　Tat-haFGF19-154-His融合蛋白通過三步色譜層析法純化。Ni-TNA金屬親和層析技術(shù)可以用來從細胞裂解液中提取融合蛋白，經(jīng)Sephadex G-25柱除鹽和緩沖液洗脫后，使用肝素瓊脂糖凝膠對融合蛋白進一步純化。經(jīng)SDS-PAGE測定，純化后的Tat-haFGF19-154-His融合蛋白純度高于95%。以往的研究表明，該融合蛋

42、白與可利用色譜法即羧甲基纖維-瓊脂糖凝膠進行純化，但產(chǎn)率較低（wu et al.2005）。利用此提的純化產(chǎn)量為171 mg/l，遠遠高于使用傳統(tǒng)方法所獲得的產(chǎn)量（wu et al.2005）。</p><p>　　該融合蛋白有促分裂活性的產(chǎn)率比野生型的haFGF低。這可能是因為Tat-PTD介導haFGF19-154直接內(nèi)化，使得haFGF19-154與細胞表面的受體相互作用減少，從而使得促有絲分裂途徑的信號傳

43、導減少。對沒有aFGF受體的COS-7細胞進行促分裂活性檢測，發(fā)現(xiàn)Tat-haFGF19-154和haFGF19-154對COS-7細胞均沒有促增殖活性(數(shù)據(jù)沒有顯示)，這表明細胞的增殖需要FGFR信號的激活（Wiedlocha et al.1996;Zalecki et al.1998）。</p><p>　　我們的數(shù)據(jù)表明，Tat-haFGF19-154-His蛋白在細胞核中分布最多。這種融合蛋白的分布取決于

44、核外序列Tat-PTD（甘氨酸，精氨酸，賴氨酸，賴氨酸，精氨酸）和haFGF（賴氨酸親-賴氨酸，亮氨酸）（Lozano et al.2000; Wu et al.2006）。越來越多證據(jù)表明，haFGF至細胞核的運輸?shù)綄Υ碳NA的合成是必需的，這可能有助于細胞的保護和促生長（Lin et al.1996; Klingenberg et al.1998; Klingenberg et al.2000）。</p><p

45、>　　重要的是，我們這里系統(tǒng)的介紹構(gòu)建穿膜肽與haFGF19-154-His的融合蛋白，Tat-haFGF19-154 ，該融合蛋白能夠簡單穿過血腦屏障。對于腦疾病治療的主要挑戰(zhàn)是如何克服治療大分子傳遞到大腦的屏障。雖然我們?nèi)匀灰獮檫@種治療作用和在神經(jīng)損傷和退化模式的重組融合蛋白進行安全測試；但這種簡單而有效的融合方法將擴大生長因子的治療作用。</p><p><b>　　參考文獻 </b&