豬2型圓環(huán)病毒、豬細小病毒核酸疫苗及豬2型圓環(huán)-豬細小-偽狂犬病三價基因工程疫苗研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病、豬細小病毒病與偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的三種重要傳染病，分別由豬圓環(huán)病毒2型(porcme Circovius聊e 2,PCV2)、豬細小病毒(porciIleparvovirus，PPV)和偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起。目前這三種傳染病在豬場并發(fā)或繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，因此，為了預防和控制這些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解決途徑。 偽狂犬病毒是一個

2、重要的活病毒載體，具有不感染人、基因組容量大、重組病毒遺傳穩(wěn)定等特點，外源基因可穩(wěn)定地插入其DNA。因此以偽狂犬病毒基因缺失株為表達載體，將其它病原的保護性抗原基因插入到PRV基因缺失疫苗株中，構建二價或多價基因工程疫苗，可以起到對多種疾病的預防作用。本文分別對PCV2和PPV核酸疫苗及PCV2-PPV-PRV三價基因工程疫苗進行了研究，其主要研究內容如下： 1．0RF2基因和VP2基因在哺乳動物細胞中的表達 將PCV2

3、 ORF2基因和PPV VP2基因酶切分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1+中，篩選重組質粒，分別命名為pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2。然后再將pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2采用脂質體法轉染IBRS-2細胞，36小時后收集轉染的細胞處理后，經Western blotting檢測，結果顯示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2質粒轉染的IBRS-2細胞分別在29 kD和64kD處出現(xiàn)特異性反應帶；而同步轉染的pcD

4、NA3．1(+)對照卻未出現(xiàn)特異性帶，從而表明重組的核酸質粒pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2構建成功，并在哺乳動物細胞中獲得表達。 2．0RF2基因和VP2基因核酸疫苗對小鼠的免疫原性及其安全性試驗 將豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因疫苗和豬細小病毒VP2基因疫苗分別肌注免疫Balb/c小鼠兩次，于首免后第14天和第56天采血，作間接ELISA抗體檢測試驗；檢測結果顯示重組的核酸疫苗都能誘導小鼠機體分別產生抗PCV和抗

5、PPV特異性抗體。于首免后第56天，采用淋巴細胞增殖試驗(MTT法)，和流式細胞儀(FACS)法對小鼠的細胞免疫進行檢測。淋巴細胞增殖試驗(MTT法)結果顯示構建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫組小鼠的脾淋巴細胞經刀豆素A(ConA)刺激后，其淋巴細胞轉化率(刺激指數)分別為1.57和1.68，明顯高于PBS空白對照組(刺激指數為1)和pcDNA-3.1(+)組(刺激指數為1.04)，但是低于PPV活疫苗組(刺激指數為1.

6、76)和PCV2活疫苗組(刺激指數為1.69)；而T細胞亞類數量的檢測結果顯示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫的各試驗組小鼠的外周血T淋巴細胞亞類CD8<'+>的數量顯著增加，而CD4<'+>的數量卻減少。 這些結果表明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗均能誘導小鼠產生細胞免疫和體液免疫應答。提取小鼠各組織器官染色體基因組進行PCR擴增，對基因疫苗的安全性進行檢測，結果顯示未能從免疫小鼠各組織的基因組擴

7、增出ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2和VP2基因未整合到小鼠染色體上，說明pcDNA-ORF2和pcDNA-+VP2核酸疫苗是安全的。 3．表達PCV2 0RF2和PPV VP2基因的重組偽狂犬病病毒的構建 將PCV2的ORF2基因和PPV的VP2基因酶切依次插入到PRV gI基因缺失通用轉移載體pPI-2．EGFP的多克隆位點中，構建轉移質粒pPI-2．EGFEORF2．VP2。然后再將該質粒與PRV基因缺失

8、株SA215基因組共轉染ST細胞，通過同源重組，構建了融合表達PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重組偽狂犬病毒株，命名為SA215(D)。經熒光檢測和PCR、Southern轉印雜交鑒定，結果表明SA215(D)構建成功；并通過SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡檢測表明PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因在重組病毒內獲得表達，產生大小約120kD的融合蛋白，而融合蛋白中的PCV2 ORF2基因、PPV VP2基

9、因蛋白都仍然保持了原有的免疫原性。此外，SA215(D)株在Vero、IBRS-2、ST和CEF細胞中的增殖滴度與親本株SA215相比無顯著差異，表明外源基因的插入不影響病毒增殖。 4．重組偽狂犬病病毒sA21 5(D)的形態(tài)學和遺傳穩(wěn)定性研究 將PRV基因缺失株和獲得的重組病毒SA215(D)的ST細胞培養(yǎng)物進行掃描電鏡觀察，均能觀察到PRV典型的病毒粒子存在，兩者形態(tài)上無大的差異，表明外源基因的插入不影響病毒的形態(tài)。

10、另外，重組病毒SA215(D)在Vero細胞上連續(xù)傳7代后，分別用VP2基因和ORF2基因的擴增引物進行PCR鑒定，結果均能擴增到ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2基因和VP2基因片段己被穩(wěn)定地插入到重組偽狂犬病毒SA215(D)基因組中，并具有遺傳穩(wěn)定性。 5．PCV2-PPV-PRV三價基因工程疫苗對小鼠的免疫原性和安全性試驗 將重組偽狂犬病毒SA215(D)制成PCV2-PPV-PRV三價基因工程疫苗接種小

11、鼠，并對該工程疫苗的免疫原性和安全性進行研究。小鼠安全性試驗顯示將重組重組偽狂犬病毒SA215(D)株，PRV SA215株和野毒Fa株分別以104和105PFU劑量接種小鼠，結果接種Fa株小鼠全部死亡，而接種SA215(D)和SA215株的小鼠全部存活；另外，將這三組免疫小鼠的組織器官進行病理切片觀察，結果接種Fa株小鼠的組織病變比SA215(D)和SA215株的嚴重，而接種SA215(D)和SA215株小鼠的組織病變比較接近。這些結

12、果表明SA215(D)株的毒力顯著低于野毒株，而與親本株SA215相近，初步驗證了該重組病毒的安全性。 將PCV2-PPVoPRV三價基因工程疫苗加強免疫小鼠后，作間接ELISA抗體檢測試驗，結果顯示SA215(D)能誘導小鼠產生較高的抗PRV，PCV2和PPV的抗體水平，其中抗PRV中和抗體與其親本株SA215抗體水平相當，能完全抵抗致死劑量PRV強毒的攻擊，具有與親本株疫苗相當的免疫保護效果；淋巴細胞增殖試驗(MTT法)結果

13、顯示SA215(D)能誘導小鼠脾淋巴細胞的增殖；而T細胞亞類數量的檢測結果顯示SA215(D)免疫小鼠能有效提高T細胞數量，增強小鼠的免疫水平。這些結果表明重組偽狂犬病毒SA215(D)制成的PCV2-PPV-PRV三價基因工程疫苗能成功誘導小鼠產生細胞免疫和體液免疫應答。重組病毒對PRV Fa株在體內定植特性研究顯示免疫重組病毒SA215(D)可以抵御PRVFa株在小鼠中的定植。以上結果表明重組病毒SA215(D)可以作為預防豬2型圓